NGS med OCAv3 assay

Molekylærpatologiske analyser (NGS) av solide svulster kan kartlegge om det foreligger bestemte molekylære biomarkører som kan gi mer målrettet diagnose og behandling.

Neste-generasjons sekvensering (dypsekvensering) er en massiv parallell sekvensering med flere millioner samtidige sekvenseringsreaksjoner. Det benyttes Oncomine Comprehensive Assay v3 (OCAv3) fra Thermo Fischer, som er et målrettet panel for deteksjon av somatiske variasjoner (punktmutasjoner, delesjoner og insersjoner, kopitallsendringer og fusjonstranskripter) i 161 gener.

Benytt Rekvisisjon Molekylærpatologi. Beskriv klinisk problemstilling med informasjon om krefttype og ønske om NGS. Velg analysepakke. Legg til ønsket analyse av eventuelle andre gener fra genpanelet nedenfor.

Det er mulig å bestille etterundersøkelser på allerede besvart prøve. Prøvematerialet vil hentes fra diagnostisk arkiv ved Avdeling for patologi, Ahus. Tilstedeværelse av tumorvev sjekkes og tumorprosent i materialet vurderes av patolog før analysen utføres.

For eksterne rekvirenter:

Rekvirenter fra andre HF kan også rekvirere analyser av prøvemateriale fra diagnostisk arkiv ved Avdeling for patologi, Ahus. Rekvisisjon kan sendes i posten, ta gjerne kontakt med ansvarlig patolog som vil rekvirere analysen i LVMS (laboratorieinformatisk system).

Formalinfiksert, parafininnstøpt tumorvev (FFPE) med minimum 20% tumorandel.

Forventet svartid er innen 28 virkedager for OCAv3. Analysen må rekvireres før mandag for å bli analysert påfølgende uke.

Det benyttes ION Torrent 'neste-generasjons sekvensering' fra Thermo Fisher med Gene studio plattform. Neste Generasjon Sekvensering (NGS) er en metode som gjør det mulig å sekvensere millioner av DNA-tråder samtidig. Dette gir betydelig mer informasjon enn tradisjonell Sanger sekvensering eller PCR rettet mot enkeltgener. Metoden prosesserer millioner av reads pr DNA-sekvens noe som gir høyere oppløsning og sikrere funn.

Analysepakker som kan bestilles og som det automatisk blir utgitt svar på:

Funn i andre kreftrelaterte gener vil bli utgitt i tabellsvar, under «andre funn» dersom de oppfyller kvalitetsparametere.

Fullstendig genoversikt i 161-geners panel Oncomine Comprehensive assay v3:

• Varianter beskrives med nomenklatur i henhold til HGSV (se nedenfor). For varianter som er beskrevet i Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) oppgis COSMIC ID eller transkript. Påviste varianter annoteres ved bruk av Ion Reporter som baserer seg på ClinVar database.  
• I tillegg sjekkes andre databaser for å best mulig annotere varianter etter spesifikk, standard terminologi (ACMG: patogen, sannsynlig patogen, usikker betydning, sannsynlig benign og benign).
• For DNA rapporteres varianter med variant allelfrekvens (VAF) > 5 % av tilfredsstillende dekning og kvalitet, samt amplifisering/ kopitallsvarianter > 10.
• Kun ikke-synonyme varianter i ekson, samt introniske varianter som er i regulatoriske områder svares ut.
• Påviste fusjonstranskripter som passerer kvalitetsparametere rapporteres i tillegg til ekson varianter som MET ekson 14 skipping og EGFR vIII (ekson 2-7 skipping).
• Påviste variantfunn, kvalitetsparametere og evt. klinisk betydning diskuteres i tverrfaglig NGS-møte, svaret utgis deretter.

• Panelet er målrettet og vil ikke inkludere alle mulige varianter. Kliniskrelevante varianter spesifiseres tydelig; andre funksjonelle varianter og varianter av usikker betydning (VUS) i kreftreleterte gener rapporteres som «andre funn».
• Varianter klassifisert som benign/sannsynlig benign rapporteres ikke ut.
• Analysen skiller ikke mellom somatiske eller kimbane varianter.
• For fusjonstranskripter kan sjelden forekommende fusjonspartnere eller bruddpunkt medføre falskt negativt resultat.
• For estimering av kopitall må tumorandel være > 20%.
• På grunn av instrumentets tekniske begrensninger vil varianter i forbindelse med homopolymerer tolkes konservativt/ ikke kunne tolkes. I tillegg er det begrensninger i kitets evne til å detektere sikre CNV-tap av kopitall også i forhold til bi-allelisk tap (må bekreftes med et større genpanel). Ved funn av enkelte sjeldne ekson skippingsvarianter i EGFR (bortsett fra ekson 2-7 skipping), BRCA 1-2, BRAF og ALK, bør dette bekreftes med annen metode.
• Ved funn i TERT gen med dette panel må resultat bekreftes med større genpanel, noe som forlenger svartid med flere uker
• For lavt innhold av tumorceller i vevet kan medføre falske negative resultater (minimum 20% tumorceller).
• Det tas høyde for viktige feilkilder som kan gi varierende DNA- og RNA-kvalitet som varierende fiksering av vev, valg av egnet fikseringsmiddel, alder for parafinblokk, for mye betennelsesceller i vev med lite tumorandel eller høy grad av nekrose, dersom materiale ikke egner seg for tolkning av NGS.

Fra mars 2018 innføres ny nomenklatur for å beskrive de ulike mutasjonene/sekvensvariasjonene ved Ahus. Tidligere benyttede uttrykk som «mutasjon» og «polymorfisme» er uklare begreper, og vil etterhvert erstattes av nøytrale utrykk som «variasjon», «endring» og «allelic-variant» ihht HGVS anbefalinger.

Beskrivelse av genetiske variasjoner er nødt til å være nøyaktige, entydige og stabile, samtidig som de må være fleksible nok til å kunne beskrive alle kjente sekvensvarianter. Nomenklaturen følger internasjonale retningslinjer fra HGVS – Human Genome Variation Society, som sier at alle varianter bør beskrives på nukleotidnivå, mens beskrivelse på proteinnivå kan gis i tillegg der det er mulig.