Oncomine DX Express test analyse med Genexus Dx Integrated Sequencer

Molekylærpatologiske analyser av solide svulster kan kartlegge om det foreligger bestemte molekylære biomarkører som kan gi mer målrettet diagnose og behandling.

Oncomine Dx Express test (eller Oncomine Dx Espress-panelet) er en kvalitativ in vitro analyse basert på neste generasjons sekvensering (NGS) på Genexus Dx Integrated Sequencer instrument.

Oncomine Dx Express test er indikert primært for ikke småcellet lungekreft. Panelet inneholder i tillegg gener relevante for andre kreftyper (se tabell under).

Oncomine Dx Express test kan detektere somatiske substitusjoner, delesjoner, insersjoner, og kopitallsvariasjoner (CNV/amplifikasjoner) for solide tumorer i 42 gener fra DNA, i tillegg til fusjoner i 15 gener og RNA exon varianter i 3 gener (MET, AR og EGFR).

Thermo Fisher oppgir at genpanelet skal dekke >85% av klinisk relevante biomarkører for krefttyper listet av ESCAT (the ESMO Scale for Clinical Actionability of mlecular Targets); panelet inneholder ikke BRCA1 og 2 og HR gener eller mer komplekse markører (MSI osv).

Fullstendig genoversikt:

Benytt Rekvisisjon Molekylærpatologi. Beskriv klinisk problemstilling med informasjon om krefttype og ønske om NGS. Legg til ønsket analyse av eventuelle andre gener fra genpanelet ovenfor.

Patologen bestiller analysepakke HTS-GENDX-NSCLC-AU for Ikke-småcellet lungekreft, og analysepakke HTS-GENDX-ONCO-AU for Blærekreft eller Kolangikarsinom.

For eksterne rekvirenter:

Rekvirenter fra andre HF kan også rekvirere analyser av prøvemateriale fra diagnostisk arkiv ved Avdeling for patologi, AHUS. Rekvisisjon kan sendes i posten, ta gjerne kontakt med ansvarlig patolog som vil rekvirere analysen i LVMS (laboratorieinformatisk system).

Formalinfiksert, parafininnstøpt tumorvev (FFPE) med minimum 20% tumorandel.

For riktig CNV calling anbefales det makrodisseksjon ved tumorandel<40%.

Sekvenseringen utføres på ekstraherte nukleinsyrer (DNA og RNA) med Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification kit utført på Ion Torrent Genexus GPI enhet.

Oncomine Dx Express tests integrert sekvenseringsforløp gir mulighet for kortere svartid enn konvensjonell sekvensering.

Forventet svartid er innen 14 virkedager etter analyse er bestilt. Analysen må rekvireres før tirsdag kl. 12.00 for å bli analysert påfølgende uke.

Det benyttes Ion Torrent 'neste-generasjons sekvensering' teknologi fra Thermo Fisher. Neste Generasjon Sekvensering er en metode som gjør det mulig å sekvensere millioner av DNA-tråder samtidig. Dette gir betydelig mer informasjon enn tradisjonell Sanger sekvensering eller PCR rettet mot enkeltgener. Metoden prosesserer millioner av reads pr DNA-sekvens noe som gir høyere oppløsning og sikrere funn.

Genexus Dx Express test er IVD- og CE merket.

Svar blir gitt ut for analysepakke genliste enten varianter er påvist eller ikke:

Alle funn i andre kreftrelaterte gener vil bli utgitt i tabellsvar, under «andre funn» dersom de oppfyller kvalitetsparametere.

• Funnet varianter rapporteres som «Påvist».
• Varianter beskrives med nomenklatur i henhold til HGVS (se nedenfor). For varianter som er beskrevet i Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) oppgis COSMIC ID og transkript nummer. Påviste varianter annoteres ved bruk av Genexus Dx software, ADF v2.1.0.
• For DNA rapporteres varianter med variant allelfrekvens (VAF) > 5 % av tilfredsstillende dekning og kvalitet/coverage > 500, samt amplifisering/ kopitallsvarianter > 6
• Kun ikke-synonyme varianter i hotspots områder, kodende sekvens, samt introniske varianter som er i regulatoriske områder svares ut.
• Påviste fusjonstranskripter som passerer kvalitetsparametere rapporteres i tillegg til eventuelle nye fusjoner med ukjente fusjonspartnere (ekspresjonsubalanse), eksonvarianter: MET ekson 14 skipping og EGFR vIII (ekson 2-7 skipping).
• I tillegg sjekkes andre databaser for å best mulig annotere varianter (ACMG: patogen, sannsynlig patogen, usikker betydning, sannsynlig benign og benign). Benign og sannsynlig benign varianter svares ut ikke.
• Kliniskrelevante varianter spesifiseres tydelig; andre funksjonelle varianter og varianter av usikker betydning (VUS) i kreftrelaterte gener rapporteres som «andre funn».
• Påviste variantfunn, kvalitetsparametere og evt. klinisk betydning diskuteres i tverrfaglig NGS-møte, svar utgis deretter til rekvirent.

• Testen er en kvalitativ test. Den skal ikke brukes til kvantitative målinger.
• Panelet er målrettet og vil ikke inkludere alle mulige varianter. Kitet dekker kun varianter angitt i vedlegg B, brukermanual part I MAN0028401-RevD-OncomineDxExpressTest-Part1-UG-CEIVD
• Nedre deteksjonsgrense (mutasjoner): 3,07 %- 5,57 % VAF.
• Nedre deteksjonsgrense (CNV- basert på ERBB2 og MET): 4,91 – 5,32 kopier.
• Analysen skiller ikke mellom somatiske eller kimbane varianter.
• Kitet er validert for 10ng input av DNA/RNA fra FFPE.
• For lavt innhold av tumorceller i vevet (minimum 20% tumorceller) kan medføre falske negative resultater og at varianter med allelfrekvensunder LOD ikke blir påvist. Estimering av eventuelle WT varianter kan da også være lavere enn normalt.
• For estimering av kopitall/amplifisering må tumorandel være ≥ 40%.
• Det tas høyde for viktige feilkilder som kan gi varierende DNA- og RNA-kvalitet som varierende fiksering av vev, valg av egnet fikseringsmiddel, alder for parafinblokk, for mye betennelsesceller i vev med lite tumorandel eller høy grad av nekrose, dersom materiale ikke egner seg for tolkning av NGS.
• På grunn av instrumentets tekniske begrensninger vil varianter i forbindelse med homopolymerer tolkes konservativt/ ikke kunne tolkes. I tillegg er det begrensninger i kitets evne til å detektere CNV- kun amplifisering kan vurderes. For tap av kopitall/ større delesjoner/ eventuelt bi-allelisk tap må det benyttes andre analyser.
• Ved funn av MET exon 14 skipping for andre tumortyper enn i NSCLC anbefales det å bruke andre metoder til konfirmering av eventuelle funn.
• Fusjoner detektert med kun expression imbalance bør analyseres med konfirmerende tester (OCAv3 eller FISH).

Fra mars 2018 innføres ny nomenklatur for å beskrive de ulike mutasjonene/sekvensvariasjonene ved Ahus. Tidligere benyttede uttrykk som «mutasjon» og «polymorfisme» er uklare begreper, og vil etter hvert erstattes av nøytrale utrykk som «variasjon», «endring» og «allelic-variant» ihht HGVS anbefalinger.

Beskrivelse av genetiske variasjoner er nødt til å være nøyaktige, entydige og stabile, samtidig som de må være fleksible nok til å kunne beskrive alle kjente sekvensvarianter. Nomenklaturen følger internasjonale retningslinjer fra HGVS – Human Genome Variation Society, som sier at alle varianter bør beskrives på nukleotidnivå, mens beskrivelse på proteinnivå kan gis i tillegg der det er mulig.

Referanse humant genom er hg19.

For detaljer, se lenke til brukermanual under feilkilder. 

Versjon:

Oncomine DX express test versjon: 6.8