Metodebeskrivelse og -begrensninger

Genomsekvensering (WGS - Whole Genome Sequencing)

Eksomsekvensering (WES - Whole Exome Sequencing)

Kopitallsvariasjon (CNV - Copy Number Variation)

I hovedregelen benyttes genomsekvensering med sekvens- og kopitallsanalyse som metode for analyse av våre genpaneler. Metoden som er benyttet er anført i våre prøvesvar, under overskriften «Metodebeskrivelse og –begrensninger». Se under for nærmere beskrivelse, og unntak fra hovedregelen.

Eksomsekvensering benyttes som metode ved mistanke om somatisk mosaisme ved:

• Genpanel for segmental overvekst
• Genpanel for RASopatier
• Genpanel for migrasjonsforstyrrelser og pontocerebellær hypoplasi

Fullstendig liste over genpanel og gener som inngår i disse.

Genetisk diagnostikk har, på samme måte som all annen diagnostikk, begrensninger ved metodene. Se utfyllende informasjon om disse nedenfor. Ved diagnostisk testing vil et normalt resultat derfor ikke utelukke at det er en genetisk årsak til pasientens sykdom/tilstand.

Analyser utført med genomsekvensering som også inkluderer kopitallsanalyse (WGS med CNV):

• Genomsekvensering er utført og etterfulgt av en automatisk filtrering av genene som inngår i aktuelt genpanel. Vi vurderer sekvensvarianter i kodende regioner og i nær intronisk sekvens (-17/+6 basepar av kodende region), samt kjente sykdomsgivende varianter utenfor disse posisjonene (rapportert i HGMD, ClinVar, intern variantdatabase).
  
  
• Kopitallsanalysen omfatter delesjoner og duplikasjoner i områdene hvor genene i genpanelet er lokalisert, ±1kb utenfor. Kopitallsvarianter som detekteres kan derfor omfatte gener utenfor det analyserte genpanelet, og kan i enkelte tilfeller avdekke trisomier og monosomier. Kopitallsanalysen har redusert sensitivitet, særlig for varianter < 5kb og i regioner med repeterte sekvenselementer (se også Segmentale duplikasjoner).
  
  
• Bærertilstander i gener med autosomal recessiv arvegang svares som hovedregel ikke ut. Dette omfatter ikke x-bundet recessive arveganger.
  
  
• Lavgradig mosaikk kan ikke detekteres med denne metoden. Påvisning av strukturelle varianter skjer kun unntaksvis og målrettet. Enkelte gener har varierende dekning. En dekningsrapport som inneholder informasjon om områder/gener med lav kvalitet/dekning kan ettersendes. Ta kontakt med laboratoriet hvis dette ønskes.

Enkelte analyser utført med genomsekvensering inkluderer også analyse av mitokondrielt DNA (WGS med mtDNA), hvor følgende begrensninger er gjeldende:

• Varianter i mtDNA med heteroplasmigrad under 10% rapporteres ikke, med mindre de er kjente sykdomsgivende varianter. Graden av heteroplasmi varierer fra vev til vev og også innad i samme vev. Påvisning av varianten, grad av heteroplasmi sammen med pasientens kliniske bilde er basis for vurdering av variantens betydning i hvert enkelt tilfelle.
  
  
• Sykdomsgivende mtDNA delesjoner finnes hos ca. 1/3 av voksne med mitokondriell dysfunksjon. Disse er vanligvis ikke til stede i blodceller. Hvis aktuelt, kan vi tilby å analysere mtDNA fra en muskelbiopsi. Vi gjør oppmerksom på at akkrediteringen ikke omfatter kopitallsanalyse av mtDNA eller analyse av mtDNA fra annet vev enn blod. Analysen er ikke egnet for påvisning av mtDNA deplesjon.

Analyser utført med genomsekvensering eller eksomsekvensering, uten kopitallsanalyse (WGS/WES uten CNV):

• Genomsekvensering/eksomsekvensering er utført og etterfulgt av en automatisk filtrering av genene som inngår i aktuelt genpanel. Vi vurderer sekvensvarianter i kodende regioner og i nær intronisk sekvens (-17/+6 basepar av kodende region), samt kjente sykdomsgivende varianter utenfor disse posisjonene (rapportert i HGMD, ClinVar, intern variantdatabase).
  
  
• Bærertilstander i gener med autosomal recessiv arvegang svares som hovedregel ikke ut. Dette omfatter ikke x-bundet recessive arveganger.
  
  
• Lavgradig mosaikk og variasjon i repeterte sekvenselementer kan ikke påvises med denne sekvenseringsmetoden. Påvisning av større strukturelle varianter som insersjoner, delesjoner og duplikasjoner, inngår ikke i analysen. Se også Segmentale dublikasjoner.
  
  
• Enkelte gener har varierende dekning. Dekningsrapport kan etterspørres fra laboratoriet.

Analyser der resultatet er verifisert med ddPCR:

• Droplet digital PCR benyttes for å undersøke variant allelfraksjon (VAF) i pasientprøve hvor en sykdomsgivende variant er påvist ved annen teknologi, evt. avklare om varianten kan være teknisk artefakt. ddPCR er en sensitiv metode som kvantifiserer mosaikkvarianter med VAF mellom 1% og 10%. Det inkluderes positiv kontroll for hver spesifikke variant ved bruk av denne analysen.

• ddPCR er en teknologi som baserer seg på å fordele en DNA-prøve i 10 000-20 000 dråper som hver danner et reaksjonskammer for PCR. DNA’et vil fordele seg tilfeldig i dråpene og det utføres PCR-amplifikasjon i hver enkelt dråpe ved bruk av gen-spesifikke primere, samt allel-spesifikke fargemerkede prober for hhv. villtype og mutert allel/variant. Etter PCR bestemmes genotypen ved fluorescensdeteksjon, der fargesignalet til hver individuelle dråpe leses av.
  

   

  
  Segmentale duplikasjoner: 
  Enkelte genomiske regioner har lav eller ingen sekvensdekning ved eksomsekvensering eller

  genomsekvensering. Dette skyldes at de har stor likhet med andre områder i genomet, slik at spesifikk gjenkjennelse av disse områdene og påvisning av varianter i disse områdene, blir vanskelig og upålitelig (Mandelker et al., Genetics in Medicine 2016; 18:1281). Disse genetiske regionene har vi identifisert ved å benytte USCS segmental

  duplication sporing, hvor områder større enn 1 kb og ≥90% likhet med andre regioner i genomet, gjenkjennes.

  Gjeldende oversikt over affiserte gener: Segmentale duplikasjoner