Laktoseintoleranse - gentest for laktase persistens

Per dags dato er fem posisjoner kjent, hvor genetiske varianter gir laktase persistens. Har man en av disse variantene opprettholdes evnen til å spalte melkesukker etter småbarns-perioden. Variantene ligger i regulatorisk område oppstrøms for laktasegenet, i intron 13 av MCM6-genet. Det er derfor vanlig å angi posisjonene med negative tall i forhold til laktasegenets første kodende nukleinsyre (istedenfor HGVS nomenklatur som vanligvis brukes i genetikk). Den viktigste varianten hos nordeuropeere befinner seg i posisjon c.-13910.

Ytterlige varianter i samme region kan også bli påvist og vil oftest ikke være tilstrekkelig undersøkt i forhold til laktaseaktivitet. Slike varianter vil vi besvare som usikre funn og anbefale funksjonell testing i tillegg. Se tabellen nederst for informasjon om forskjellige varianter.

• Klinisk mistanke om laktoseintoleranse fra ca. 3 års alder grunnet magesmerter, diaré og luftplager el.l.
• Genanalysen kan brukes både til å påvise og til å utelukke arvelig betinget laktasemangel.
• Analysen kan imidlertid ikke påvise laktasemangel som er sekundær til annen tarmsykdom som cøliaki, akutt gastroenteritt og inflammatorisk tarmsykdom, andre former for melkeintoleranse eller allergi overfor melkeproteiner. En meget sjelden og potensielt livstruende form for genetisk betinget laktasemangel, med fravær av laktase fra fødselen av, kan heller ikke påvises ved denne gentesten.

EDTA-fullblod

• Prøven tas på EDTA-rør. Nødvendig prøvevolum: 3 ml fullblod.
• NB! Røret skal ikke sentifugeres.
• EDTA-røret sendes til Hormonlaboratoriet.

• Det er per i dag hovedsakelig 5 posisjoner identifisert der kjente varianter vil gi laktase persistens, dvs man beholder evnen til å spalte laktose i voksen alder. Se tabellen nederst for oversikt over forskjellige varianter.
• Varianter i posisjon c.-13910:
  Hos etniske nord-europeer vil de fleste være homozygot TT eller heterozygot TC i posisjon c.-13910. Denne varianten gir laktase persistens.
  Hos ca 10% av nord-europeer påviser man C-varianten i begge alleler (homozygot C/C) i c.-13910. Det fører vanligvis til en gradvis utvikling av laktasemangel (synonym: laktase nonpersistens) med oppstart fra ca 3-årsalderen.
  Tidspunktet hvor kliniske symptomer opptrer kan variere mellom ulike folkegrupper. Fra ca 13-årsalderen er laktasemangelen manifest hos de aller fleste. Hvorvidt pasienten opplever klinisk laktoseintoleranse eller ikke, avhenger av størrelsen på laktoseinntaket i tillegg til individuelle faktorer. Barn med c.-13910 C/C og symptomer på laktoseintoleranse bør trolig likevel innta små mengder melkeprodukter av hensyn til ernæring og vekst. Det finnes også et begrenset antall personer som har denne genotypen uten å utvikle laktasemangel.
• Varianter i andre posisjoner:
  Det er viktig å være klar over at c.-13910C >T-varianten (T/C eller T/T i posisjon c.-13910), som gir laktase persistens, i hovedsak forekommer i den nordeuropeiske befolkningen. Andre befolkningsgrupper vil i denne posisjon ofte ha C/C, men hos noen av dem vil det foreligge andre varianter som likevel gir laktasepersistens. Dette gjelder variantene c.-13907C >G, c.-13915T >G og c.-14010G >C, som hittil er observert i befolkninger fra f.eks. Nordøst-Afrika og Midt-Østen. Som eksempel er allelfrekvensen for c.-13915T >G rapportert å være ca. 56 % i en populasjon fra Kuwait (Hill SC et al. 2013). Foreligger en av disse variantene vil det være assosiert med laktasepersistens og dermed evnen å spalte laktose også i voksen alder (Segurél 2017).
• Det er observert ytterlige varianter i samme region som ikke er avklart like godt i forhold til laktase persistens eller non-persistens som f.eks. -13913T >C. I tillegg finnes det varianter som ikke er undersøkt i forhold til laktaseaktivitet og som derfor må betraktes som varianter av ukjent signifikans.
• Hos personer med annen etnisitet enn nordeuropeisk, bør man derfor være liberal med å utføre funksjonell testing, uavhengig av genetisk testing.

Prøven blir fortrinnsvis genotypet for varianten c.-13910C >T ved bruk av real-time PCR. Dersom analyseresultatet tyder på at det foreligger andre mutasjoner forbundet med laktoseintoleranse blir prøven videre sekvensert. Det sendes da ut informasjon til rekvirent om at prøven undersøkes videre.

Genotyping ved bruk av real-time PCR

Forbehandling

Ingen

Prinsipp

Real-time PCR med påvisning av den genetiske varianten rs4988235 C/T ved hjelp av spesifikke fluorescerende prober.

Metode

DNA ekstraheres fra leukocytter i EDTA-fullblod og brukes som templat for en real-time PCR hvor området omkring 13910 basepar oppstrøms for selve laktasegenet amplifiseres. De genetiske variantene påvises direkte ved spesifikke fluorescerende prober.

Metoden ble tatt i bruk ved Hormonlaboratoriet som rutineanalyse i februar 2005 og endret til real-time PCR metode i oktober 2007.

Gentest ved bruk av Sanger sekvensering

Forbehandling

Ingen

Prinsipp

PCR med påfølgende Sanger sekvensering som benyttes for å lese av rekkefølgen av baseparene i ett spesifikt område i DNA.

Metode

DNA-tråden kopieres opp ved bruk av genspesifikke primere, enzymet DNA-polymerase, nukleotider (dNTP`er), MgCl2 og buffer. Baserekkefølgen kan

avleses ved bruk av kapillær elektroforese. Fluorescens-merkede DNA-fragmenter med ulik lengde vandrer gjennom polymerfylte kapillærer og de ulike fargesignalene detekteres ved hjelp av en laser og et kamera. Rekkefølgen på avlest sekvens settes sammen og sammenliknes mot en referansesekvens.

I denne metoden benyttes primere som ligger i det regulatoriske området oppstrøms for LCT-genet. Metoden gjør det mulig å undersøke varianter fra nukleinsyre c.-13843 - c.-14206 (363bp).

Det viktigste karbohydratet i melk er disakkaridet laktose (melkesukker). Morsmelk inneholder 67 g/l og kumelk 45 g/l. Laktose må hydrolyseres til monosakkaridene galaktose og glukose før det kan absorberes av tarmcellene. Dette katalyseres av enzymet laktase som også betegnes laktase-phlorizin-hydrolase (E.C. 3.2.1.108). Enzymet befinner seg i cellemembranen til enterocyttene i tynntarmen, spesielt i midtre jejunum. Høy laktaseaktivitet er viktig hos nyfødte for å kunne utnytte sukkeret i morsmelken. Deretter tapes aktiviteten gradvis slik at de fleste voksne mister evnen til å spalte laktose (laktase nonpersistens), men det er store etniske forskjeller. I Europa fordeler det seg med høyest forekomst av bevart laktaseaktivitet (laktase persistens) blant voksne i nordvest og lavest i sørøst. I Sverige har over 90 % av befolkningen laktase persistens, mens andelen er 30-40 % i Hellas. Blant indere som bor i England har over 70 % laktase nonpersistense og medfølgende laktoseintoleranse. Laktasemangel fører til at laktose passerer ufordøyd gjennom tynntarmen ned til bakteriene i tykktarmen. Dette starter en gjæringsprosess som fører til dannelse av gasser med blant annet kolikklignende smerter, flatulens og diaré som resultat og dette betegnes som laktoseintoleranse. Laktasemangel kan registreres fra 2-3 års alder med avtagende enzymaktivitet i tarmen og komplett fravær ved 5-10 års alder, men med stor individuell variasjon.

Det finnes flere funksjonelle tester for laktasemangel. Laktaseaktiviteten kan bestemmes direkte i en tynntarmsbiopsi, men det er vanligere å utføre belastningstester. Inntak av laktose vil gi en økning i blodglukose etter 15-45 minutter hos personer som har laktase. Gjæring av laktose i tykktarmen hos personer med laktasemangel fører til dannelse av hydrogengass som kan påvises i utåndingsluften, og dette blir brukt i belastningstester. Felles for belastningstestene er at de er tidkrevende og ikke optimale med hensyn til sensitivitet og spesifisitet.

Tabell over varianter som gir laktase persistens

*Tyder på noe laktase-persistens (LP), men mindre godt kartlagt enn varianter i c.-13910, c.-13915.

Varianter med noe dokumentasjon:

c.-14011C >T; c.-14028T >c, c.-13779G >C, : In vitro studier viser effekt på promoter aktivitet (Liebert 2016).

c.-13913T >C: Varianten er funnet i noen populasjoner (Segurél 2017)

Varianter har lite dokumentasjon:

Varianter som er observert, men ikke godt nok karakterisert i forhold til regulering av laktaseaktivitet: c.-13914G >A, c.-13915T >C, c.-13909C >T, c.-13908C >T, c.-13880G >A. Disse variantene velger vi å svare ut som usikre i forhold til persistens av laktaseaktivitet. Her bør man vurdere å utføre funksjonelle tester.

I litteraturen er også c.-22018G >A (Enattah 2002) beskrevet, som vanligvis foreligger sammen med c.-13910C >T (perfect linkage disequilibrium). Det er ikke vist at c.-22018G >A alene gir laktasepersistens og det er derfor ikke nødvendig å undersøke hvilken variant som foreligger i posisjon c.-22018.