EGFR variantanalyse

EGFR variantanalyse relatert til pasienter med lungekreft av type NSCLC (Non-Small Cell-Lung-Cancer)

Indikasjoner

Identifisere pasienter med lungekreft av type NSCLC (Non-Small-Cell-Lung-Cancer), som har tumorer med aktiverende variasjoner i genet som koder for epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). Dette for å kunne velge ut pasienter til behandling med småmolekylære tyrosinkinasehemmere (TKI) rettet mot EGFR. Alle NSCLC undersøkes unntatt plateepitelkarsinomer.

Til analysen brukes tumorbiopsi i form av formalinfiksert parafininnstøpt vev (FFPE), cytologiske prøver eller blodprøver for undersøkelse av sirkulerende cellefritt DNA (cfDNA).

Kliniske data tyder på at pasienter med NSCLC-tumorer med aktiverende variasjoner i genet som koder for EGFR (vanligvis delesjoner i ekson 19 eller L858R-punktmutasjon i ekson 21), har en høy responsrate og forlenget progresjonsfri overlevelse ved behandling med anti-EGFR tyrosinkinasehemmere, både i første- og andrelinjebehandling. Andre mindre vanlige variasjoner, som G719X-substitusjoner i ekson 18, predikerer også respons på anti-EGFR-behandling. Variasjonene ligger i området for ATP-binding i tyrosinkinase-domenet (EGFR, ekson 18-21, kromosom nr.7), og selv om man har identifisert over 250 mutasjoner i dette området, er det to variasjoner som forekommer hyppigst og som utgjør ca. 90% av tilfellene. Dette er delesjon i ekson 19 (fjerning av aminosyrene 747-750) og punktmutasjon L858R i ekson 21 (aminosyreskifte fra leucin til arginin i posisjon 858) med hhv 45% og 40-45% av tilfellene.

Variasjoner i EGFR-genet gir blant annet økt EGFR-aktivitet, noe som medfører at ATP kan bindes til tyrosinkinase-domenet intracellulært på reseptoren. Denne fosforylerer og aktiverer proteiner som er aktører i nedstrøms signalkaskader. Tyrosinkinasehemmere konkurrerer med ATP om å binde seg til tyrosinkinase-domenet og dette fører til blokkering av reseptorens nedstrøms signaler.

Variasjoner i EGFR-genet forekommer hos 10-15% av kaukasiske pasienter med NSCLC, oftere hos kvinner, ikke-røykere, asiatere og pasienter med adenokarsinom.

Etter hvert vil de fleste NSCLC pasienter med variasjoner i EGFR-genet utvikle progressiv sykdom etter behandling med EGFR tyrosinkinasehemmere. Hos ca 60% skyldes dette sekundære resistente variasjoner, vanligvis T790M-variasjon i ekson 20. Hos enkelte pasienter kan slike sekundære resistente variasjoner detekteres i tumorene før anti-EGFR TKI-behandling. Selv om disse pasientene fortsatt har høy responsrate på behandling ser det ut til at de har en betydelig kortere progresjonsfri overlevelse enn pasienter med tumorer som mangler disse sekundære variasjonene. Tidligere var det ikke flere behandlingsmuligheter for disse pasientene, men for få år siden ble en tredje generasjons tyrosinkinasehemmer, Tagrisso® (Osimertinib), godkjent for bruk på pasienter med avansert eller metastatisk ikke-småcellet lungekreft med påvist T790M-mutasjon. Osimertinib binder irreversibelt til EGFR-reseptor med T790M-variasjon (og sensitiverende variasjon), og gir forlenget progresjonsfri overlevelse for pasienter som har progrediert etter bruk av andre generasjons TKI. EGFR variantanalyse kan brukes som en ledsagende diagnostisk test for bruk av Tagrisso® for pasienter med påvist T790M-variasjon. Bestemmelse av EGFR T790M-variantstatus kan også gjøres i blodprøver som et alternativ til invasiv metode og for å følge pasienter i behandlingsforløp, se avsnitt under om EGFR variantanalyse i sirkulerende cellefritt DNA (cfDNA).

EGFR variantanalyse i sirkulerende cellefritt DNA (cfDNA)

EGFR variantanalyse utføres på fritt sirkulerende tumor-DNA (cfDNA) fra EDTA-blod. Undersøkelse av EGFR variantstatus i blodprøver kan brukes i de tilfellene der det ikke er mulig å foreta en lungebiopsi men også til å måle forskjeller i mutasjonsnivå (mutation load) over tid.

Resultatene gir et semi-kvantitativt mål på mengden av mutant cfDNA i en prøve. Semi Quantitative Index (SQI) viser lineær sammenheng med antall EGFR variantkopier i cfDNA per mL plasma, se oversikt i tabell 2 samt nedre grense for sensitivitet, LOD. SQI-verdiene omregnes automatisk og svar gis ut i kopitall/mL plasma.

Formalinfiksert parafininnstøpt tumorvev, FFPE

• Biopsier
• Resektater
• Celler i suspensjon høstet ved cytologisk prøvetaking.

Patolog vurderer preparatet og velger ut egnede snitt. 5-6 snitt med tykkelse 5 µm og minst 10% tumorinnhold. Dersom preparatet inneholder svært lite prøvemateriale stanses hele området med tumorvev ut, og brukes i sin helhet i analysen. Remissen merkes med prosentandel av tumorvev og eventuell nekroseandel.

• Ekstraksjon av FFPE-materiale med cobas® DNA Sample Preparation Kit
• Ekstraksjon av cfDNA fra EDTA plasma med cobas® cfDNA Sample Preparation Kit
• Real-time PCR ved bruk av cobas® EGFR Mutation Test Kit v2 på cobas® z480 fra Roche Diagnostics.
• EGFR mutasjonstest v2 er en allel-spesifikk real-time PCR som dekker i alt 42 genetiske variasjoner i det epidermale vekstfaktorreseptorgenet EGFR, se tabell 1 for detaljert informasjon.

For FFPE-materiale

Deteksjonsgrensene for cobas® EGFR Mutation Test v2 varierer for de ulike variantene Forutsetningen er at vevet inneholder minimum 10% tumorceller, da kan testen detektere et variantnivå mellom 1,3% og 7,2%. Unntaket fra dette er ekson 19 delesjon, 2240_2257del18 som har deteksjonsgrense på 13,4%. Spesifikke deteksjonsgrenser kan fås på forespørsel ved Genteknologisk seksjon, TLMB.

For sirkulerende cellefritt DNA, cfDNA

Oversikt over nedre deteksjonsgrense (LOD) for de ulike variasjonene er testet ut av leverandør og listet i tabellen under.

Tabell 1: Sensitivitet ved bruk av cobas ® EGFR Mutation Test v2 for cfDNA

* LOD: Limit of Detection

EGFR variantanalyse analyseres èn gang pr uke, svartid er 5 virkedager fra prøven mottas ved Molekylærgenetisk diagnostikk, TLMB.

For lavt innhold av tumorceller i vevet kan medføre falske negative resultater (minimum 10% tumorceller).

For høy andel av nekrotisk vev kan medføre usikkerhet i analysesvaret. Vevspreparater positiv for EGFR-variasjoner med opptil 60% nekrotisert vev, har vist seg å ikke interferere på resultatet, mens tilsvarende tall for vevspreparater uten mutasjon er 85% (disse feilkildene blir i prinsippet utelukket ved at preparatene vurderes av patolog).

cobas®EGFR Mutation Test v2 detekterer kun EGFR-varianter hos metastatiske NSCLC-pasienter med tumorer som har substitusjoner i ekson 18, delesjoner i ekson 19, innskudds- og variasjoner, substitusjonsmutasjoner i ekson 20 og ekson 21. Prøver med negativt resultat kan derfor i prinsippet, inneholde EGFR-varianter som ikke detekteres av analysen.

cobas®EGFR Mutation Test v2 viser kryssreaktivitet mellom L747S-mutasjon og ekson 19 delesjon, en sjelden ervervet variasjon som kan gi resistens mot TKI-behandling.

Fra mars 2018 innføres ny nomenklatur for å beskrive de ulike mutasjonene/sekvensvariasjonene ved Ahus. Tidligere benyttede uttrykk som «mutasjon» og «polymorfisme» er uklare begreper, og vil etterhvert erstattes av nøytrale utrykk som «variasjon», «endring» og «allelic-variant» ihht HGVS anbefalinger.

Beskrivelse av genetiske variasjoner er nødt til å være nøyaktige, entydige og stabile, samtidig som de må være fleksible nok til å kunne beskrive alle kjente sekvensvarianter. Nomenklaturen følger internasjonale retningslinjer fra HGVS – Human Genome Variation Society, som sier at alle varianter bør beskrives på nukleotidnivå, mens beskrivelse på proteinnivå kan gis i tillegg der det er mulig.

Kit leverandøren (Roche) beholder foreløpig «eldre» nomenklatur i sin beskrivelse av genetiske variasjoner. I svarrapporten gis resultatene ut med både HGVS nomenklatur og «eldre» nomenklatur.