Kreft hos barn kan inndeles i 2 hovedgrupper: leukemier og solide svulster. Den patologisk-anatomiske utredning er prinsipielt basert på 3 områder: morfologi, immunfenotype og genetikk som undersøkes suksessivt etter hverandre avhengig av de diagnostiske og kliniske behov i et gitt tilfelle. Dette gjelder både for leukemier og solide svulster, men metodene kan variere med type prøver som er tatt.

Leukemier

Morfologi: Utstryk fra benmarg og blod vurderes cytologisk. Det tas i tillegg benmargsbiopsi for histo­logisk undersøkelse. Biopsien er viktig for å vurdere cellulariteten og infiltrasjonsgraden. Konklusjonen fra de morfologiske undersøkelser er som regel at det enten er overbevisende forandringer som ved leukemi, at resultatet er usikkert eller klart negativt. Ved positivt eller usikkert resultat er det helt nødvendig å gå videre med immunfenotyping.

Spinalvæske undersøkes på forekomst av celler (telling).

Immunfenotype: Celler fra benmargsaspirat og/eller blod undersøkes med flowcytometri på normal eller unormal ekspresjon av antigener både på overflaten og inne i cellene. Med denne teknikken kan man analysere mange tusen celler på kort tid. Metoden gir svært begrenset morfologisk informasjon, men det er mulig å se på forekomsten av flere antigener i samme celle. Dette kan være avgjørende for å komme frem til en korrekt diagnose og for å etablere et fenotypisk «vindu» som er karakteristisk for en individuell pasient, og som kan brukes for senere analyser i oppfølgingen av pasienten etter kjemoterapi.

Immunhistologiske undersøkelser av benmargsbiopsi er ikke nødvendige hvis leukemien er tilfredsstillende klassifisert ved hjelp av flowcytometri.

Celler i spinalvæsken immunfenotypes enten immuncytologisk på cytospinpreparater eller med flowcytometri. Etter internasjonal overenskomst trenger man minst 15 positive «events» (dvs. celler) for å kalle et flowcytometrisk resultat for positivt. Dette kan by på problemer når celletallet i spinalvæsken er svært lavt. Her vil en immuncytologisk undersøkelse kunne gi et resultat som er basert på en kombinasjon av cytomorfologi og immunfenotype.

Genetikk: Leukemicellene kan undersøkes ved hjelp av klassisk cytogenetikk, in situ hybridi­sering eller molekylærgenetiske metoder som ofte er basert på PCR-teknikker. Hovedfordelen med klassisk cytogenetikk er at den representerer en pan-genomisk metode som analyserer alle kromosomer for amplifikasjoner, tap eller translokasjoner av genmateriale. Ulempen er at metoden er avhengig av å dyrke cellene for å høste metafaser, noe som tar for lang tid (uker) i forhold til start av behandling. Noen genetiske avvik som er viktige i vurderingen av leukemier, er dessuten submikroskopiske slik at de ikke sees ved analysen av kromosombåndene.

In situ hybridisering og ulike PCR-metoder er skreddersydd for å analysere kjente genforand­ringer med en spesifisitet og sensitivitet som er høyere enn klassisk cytogenetikk. Analysen er rask (1–2 dager) og lett å standardisere, men har i forhold til cytogenetikken den ulempen at man kun får svar på det man har spurt om, og ikke registrerer andre eventuelle genetiske abnormiteter.

Både lymfatiske og myelogene leukemier er kjent for en rekke genetiske forandringer som er assosiert med prognosen, og som derfor brukes til valg av behandling. Noen behandlings­former er rettet spesifikt mot proteiner som er til stede eller forandret på grunn av en genetisk aberrasjon. Derfor utføres i dag en rekke genetiske standardundersøkelser enten ved hjelp av PCR eller in situ-hybridisering når leukemien er flowcytometrisk klassifisert.

Undersøkeler på MRD (minimal residual disease) etter behandling utføres flowcytometrisk og molekylærgenetisk (PCR) avhengig av den immunologiske og genetiske fenotypen som ble etablert på diagnosetidspunktet.

Anbefalinger:

• For leukemier må utstryk fra både benmarg og blod vurderes morfologisk.
• Celler fra benmargsaspirat og/eller blod undersøkes med flowcytometri med henblikk på normal og unormal ekspresjon av antigener både på overflaten og intracellulært.
• Immunhistologiske undersøkelser av benmargsbiopsi er nødvendig der leukemien ikke er tilfredsstillende klassifisert ved hjelp av flowcytometri.
• Leukemicellene undersøkes ved klassisk cytogenetikk, in situ hybridisering og/eller ulike PCR‑metoder for kjente genforandringer.
• Kravene til disse undersøkelser er nedfelt i internasjonale behandlingsprotokoller som oppgraderes fortløpende.

Solide tumores

Morfologi: Biopsier fra solide svulster vurderes primært histologisk i motsetning til prøver fra leukemier der den cytologiske analysen er sentral. Biopsier kan tas med grovnål (tru-cut) eller som skjærebiopsi. Grovnålsbiopsier medfører ingen post-operative komplikasjoner som man kan se etter skjærebiopsier (f. eks. hematogen utsæd av tumorceller eller adheranser ved abdominale svulster), men har klare ulemper: Materialet er ofte svært sparsomt og kan ikke vurderes for representativitet før etter 1–2 dager på grunn av innstøping og skjæring av histologiske snitt.

Derfor anbefales en kombinert cytologisk (finnålsaspirasjon, FNAC) og histologisk (grovnål) undersøkelse. Finnålsaspirasjonen utføres først og som regel under ultralydveiledning. Utstryk fra disse celler farges umiddelbart (3–5 minutter) og vurderes av cytolog mens pasienten venter i narkose. Fargingen gir opplysninger om prøvens representativitet slik at det samme området av lesjonen kan brukes til grovnålsbiopsi. Det er viktig å utføre minst 4 cytologiske aspirasjoner og 4 grovnålsbiopsier for å sikre tilstrekkelig materiale til spesialundersøkelser som vil variere med den kliniske problemstillingen og resultatet fra den første cytologiske hurtigfarging. To av biopsiene støpes i parafin, mens de andre dypfryses for fenotypiske og genetiske spesialundersøkelser som ikke kan utføres på parafinsnitt. Av det cytologiske finnålsaspiratet lages cytospinpreparater som er velegnet til immunfenotypiske og interfase-cytogenetiske undersøkelser. Aspirerte celler kan også dypfryses til senere ekstraksjon av RNA, DNA og proteiner.

Immunfenotype: Ved mange solide svulster kjenner man til en karakteristisk kombinasjon av cellulære antigener som kan analyseres ved hjelp av immuncytologi (f. eks. cytospin fra FNAC) eller immunhistologi av biopsimateriale. Slike undersøkelser er standardprosedyrer i alle patologisk-anatomiske laboratorier.

Genetikk: Genetiske undersøkelser ved solide svulster har flere formål: De kan brukes diagnostisk for å påvise genetiske aberrasjoner, f. eks. translokasjoner som er karakteristiske for en bestemt entitet. Diagnostiske tester er spesielt viktige ved enkelte bløtdelssvulster der man ikke kjenner til en spesifikk immunfenotype I tillegg finnes en rekke genetiske forand­ringer, f. eks. mutasjoner eller kopitallsforandringer (amplifikasjoner/delesjoner) som har prognostisk og/eller terapeutisk betydning, og som derfor er med å bestemme behandlingen. Helgenomisk sekvensering av solide svulster har avslørt ulike typer mutasjoner som f. eks. av ALK genet i neuroblastom eller B-RAF genet ved Langerhanscelle histiocytose som kan utnyttes til personrettet behandling.

Translokaksjoner undersøkes med in situ hybridisering (FISH) eller PCR-basert påvisning av et fusjonsgen. Kopitallsvorandringer påvises med in situ hybridisering av enkeltgener eller hel­genomisk med arrayCGH. Mutasjoner undersøkes med Sanger sekvensering eller – hvis høy sensitivitet er påkrevet – med massiv parallel (dyp) sekvensering (NGS). Det finnes kommersi­elle platformer som muliggjør en synkron analyse av fusjoner, mutasjoner og kopitalls­forand­ringer av flere titalls gener som er relevante i diagnostikken av solide barnesvulster.

Klassisk cytogenetikk har i de senere år fått mindre betydning i utredningen av solide svulster av årsaker som er belyst ovenfor. Dyrkning av celler fra solide svulster til metafase er ofte vanskeligere ved solide svulster enn ved celler fra blod og benmarg.

In situ-hybridisering og PCR-baserte metoder gir raske og pålitelige svar. Både in situ-hybridisering, arrayCGH og mange PCR-baserte analyser av enkeltgener inkludert NGS kan utføres på formalin-fiksert parafin-innstøpt (FFPE) materiale. Dette innebærer at andelen tumorceller i en prøve kan bestemmes på histologiske snitt før de molekylærgenetiske analyser i gangsettes. Tilblanding av normale celler kan være problematisk når man velger ekstraksjons-baserte metoder. Et ukjent antall ikke-tumorceller i en prøve kan gi falsk negative resultater. Det er derfor påkrevet at en patolog har analysert prosentandelen tumorceller i et cytologisk eller histologisk materiale før dette leveres til molekylærgenetikeren for ekstraksjon av f. eks. RNA eller DNA.

Anbefalinger:

• Biopsier fra solide svulster vurderes primært histologisk. Det anbefales en kombinert cytologisk (finnålsaspirasjon, FNAC) og histologisk (grovnål) undersøkelse. Biopsi tas som regel ultralydveiledet.
• Karakteristiske kombinasjoner av cellulære antigener for solide svulster analyseres ved hjelp av immunhistologi og immuncytologi.
• Både gensekvensering, in situ-hybridisering og arrayCGH utføres avhengig av type tumor for å konfirmere den histologiske diagnosen og/eller vurdere prognosen/velge adekvat behandling.
• Analysering av prosentandel tumorceller i et cytologisk eller histologisk materiale må gjøres før videre molekylærgenetisk testing.

Kravene til disse undersøkelser er nedfelt i tumor-spesifikke, internasjonale behandlings­proto­koller som oppgraderes fortløpende.