Molekylærpatologiske analyser på tumorvev

Kat.nr: A0120/6, Idylla, BioCartis.

Analysen er validert fra leverandørs side på FFPE vev og inhouse på eluat. Begge valideringene er utført på vev fra pasienter med NSCLC.

Prosedyreprinsipp

Biocartis Idylla™ GeneFusion Panel er en helautomatisk in vitro-diagnostisk test som er tiltenkt for kvalitativ påvisning av spesifikke genfusjoner av ALK, ROS1, RET og MET-ekson 14 overhopp. Idylla™ GeneFusion Panel er beregnet for bruk med formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE)-tumorvevssnitt fra pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Idylla™ GeneFusion Panel dekker hele prosessen fra prøve til resultat, inkludert helintegrert RNA- og DNA-ekstraksjon, revers transkripsjon av mRNA, sanntids PCR-amplifikasjon og -påvisning, dataanalyse og resultatrapportering.

Krav til prøver

• Minimumsmengde vev: 20 mm² (10 µm).
• Minimumsmengde eluat: 15 ng DNA/30 ng RNA eller 20 ng DNA/20 ng RNA.
• Minimum tumorprosent: 10 %

Panelet dekker følgende fusjonspartnere

• ALK: dekker 17 fusjoner som inkluderer ELM4, KIF5B, H1P1, KLC1, TPR, TFG
• ROS1: dekker 13 fusjoner som inkluderer CD75, SDC4, EZR, TPM3, GOPC, LRIG3
• RET: dekker 7 fusjoner som inkluderer KIF5B, CCDC6
• MET exon 14 skipping som inkluderer transkriptdeteksjon ved exon13-exon 15 junction.

Panelet detekterer også ALK, ROS1 og RET expression imbalance. Expression imbalance resultat rapporteres bare dersom spesifikke fusjoner ikke detekteres. Resultatet skal bekreftes med annen metode.

Deteksjonsgrense: ALK (3000-10 000 kopier), ROS1 (3000 kopier), RET (5000 kopier) og MET exon 14 skipping (3000 kopier)

Begrensninger

• Kun validert for bruk med FFPE-tumorvevssnitt fra pasienter diagnostisert med NSCLC.
• Dette er en kvalitativ test, og er ikke beregnet for kvantitative målinger.
• Panelet er ikke tiltenkt diagnostisering av NSCLC.

• Bruk av prøver som ikke oppfyller kriterier for mengde vev, nukleinsyrer og andel neoplastiske celler kan gi upålitelige eller ugyldige resultat eller at mutasjoner nær LOD ikke blir påvist.
• DNA-fragmentering/lav forekomst av amplifiserbart DNA kan gi falskt/inkonklusivt resultat.

• Forekomst av hemmere i prøven påvirker ytelsen og kan gi høyere deteksjonsgrense
• Bruk av fargede prøver kan generere ugyldige resultater.

For detaljer, se Idylla GeneFusion Panel | Biocartis.

Kat.nr: A0020. Idylla, BioCartis.

Analysen er validert på FFPE-vevssnitt med opphav i kolorektale tumorlesjoner (fra leverandør). I tillegg er den validert internt på FFPE på lungemateriale fra pasienter med NSCLC.

Gen:

KRAS: homo sapiens Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, NM_004985.3.

Prosedyreprinsipp

Idylla™ KRAS Mutation Test påviser mutasjoner i exon 2, 3 og 4 av KRAS-onkogenet. Testen består av fem allelspesifikke multiplekse PCR-reaksjoner som er utviklet spesifikt for å forsterke KRAS-gensekvenser med mutasjon i kodon 12, 13, 59, 61, 117 og 146. Et konservert fragment i knutepunktet for intron 4/exon 5 i KRAS-genet, forsterkes samtidig. Denne PCR-reaksjonen fungerer som en prøvebehandlingskontroll (SPC) som sjekker at hele prosessen fra prøve til resultat er tilfredsstillende utført, og finnes i alle de fem multipleksene. Denne kontrollreaksjonen er i tillegg en måling av mengden amplifiserbar DNA i prøven, og brukes i analysen av prøvens mutasjonsstatus.

Krav til prøver

• Minimumsmengde vev: 25 mm² (10 µm).
• Minimum tumorprosent: 10 %

Følgende mutasjoner i KRAS kan detekteres

Analysen kan detektere følgende 21 mutasjoner i ekson 2, 3 og 4.

Ekson 2:

• Kodon 12: G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V.
• Kodon 13: G13D.

Ekson 3:

• Kodon 59: A59T, A59E og A59G, disse skilles ikke.
• Kodon 61: Q61H (c.183 A >C og c.183 A >T, disse skilles ikke).
• Q61K (c.181C >A og c.180_181delinsAA, disse skilles ikke).
• Q61R, Q61L, disse skilles ikke.

Ekson 4:

• Kodon 117: K117N (c.351A >C og c.351A >T, disse skilles ikke).
• Kodon 146: A146P, A146T og A146V, disse skilles ikke.

Deteksjonsgrensen (LOD) for alle KRAS mutasjoner er 5 %, bortsett fra G12R som har en deteksjonsgrense på 1 %.

Begrensninger

• Bruk av prøver som ikke oppfyller kriterier for mengde vev, nukleinsyrer og andel neoplastiske celler kan gi upålitelige eller ugyldige resultat eller at mutasjoner nær LOD ikke blir påvist.
• DNA-fragmentering/lav forekomst av amplifiserbart DNA kan gi falskt/inkonklusivt resultat.
• Forekomst av hemmere i prøven påvirker ytelsen og kan gi høyere deteksjonsgrense.
• Testen skal ikke brukes til diagnostisering av kolorektalkreft eller til overvåkningsformål.
• Dette er en kvalitativ test. Testen er ikke beregnet på kvantitativ måling av allellefrekvenser.
• Når det gjelder heterogenitet av prøver eller flere mutasjoner, rapporteres kun den påviste dominante mutasjonen. Heterogenitet mellom lesjoner må vurderes.
• Feil innsamling eller håndtering av prøver kan føre til degradert eller deaminert DNA, og kan påvirke resultatene som ble oppnådd med testen.
• Bruk av fargede prøver kan generere ugyldige resultater.

For detaljer, se Idylla KRAS Mutation Test | Biocartis

Kat.nr: A0100/6. Idylla, BioCartis.

Godkjente prøvetyper for Idylla™ MSI Test er FFPE-vevssnitt fra kolorektale tumorlesjoner. Det utføres også MSI med tumorvev fra andre organer, men svar gis da ut med forbehold.

Mol.pat analyse på MSI utføres bare dersom en eller flere av de fire dMMR proteinene (MLH1, MSH2, MSH6 eller PMS2) er negative på immun, eller ved usikkerhet rundt tolkning av resultat på disse analysene.

Prosedyreprinsipp

Idylla™ MSI Test er en fullautomatisert test som utføres på Biocartis Idylla™-systemet. Analysen består av rensing av nukleinsyrer fra FFPE og PCR på syv monomorfe biomarkører. En høyoppløselig smeltekurveanalyse (HRM) utføres på PCR-produktet. Idylla software tolker og rapporterer MSI status dersom de interne prosesskontrollene godkjennes.

Krav til prøver

• Minimumsmengde vev: 25 mm² (10 µm).
• Minimum tumorprosent: 20 %

Følgende biomarkører for MSI kan detekteres

En kjøring anses som gyldig dersom minst fem gir gyldig resultat. En prøve er mikrosatellittinstabil (MSI) dersom prøven har to eller flere markører som viser mutasjon. Dersom tre eller flere av biomarkørene feiler på de interne prosesskontrollene vil prøven rapporteres som Invalid.

Begrensninger

• Metoden er validert med FFPE fra vev med opphav fra kolorektal tumor. Vev med annet opphav kan ha annen mutasjonsprofil med mutasjoner i andre biomarkører enn disse syv, og dermed feiltolkes som mikrosatellitt stabil fenotype (MSS). Annet vev er ikke validert.
• Bruk av prøver som ikke oppfyller kriterier for mengde vev, nukleinsyrer og andel neoplastiske celler kan gi upålitelige eller ugyldige resultat eller at mutasjoner nær LOD ikke blir påvist.
• Testen skal ikke brukes til diagnostisering, og heller ikke til overvåkningsformål.
• Dette er en kvalitativ Test. Testen skal ikke anvendes til kvantitative målinger av allelfrekvenser.
• Når det gjelder heterogenitet av prøver eller flere mutasjoner, rapporteres kun den dominante påviste mutasjonen. Heterogenitet skal tas i betraktning, og en representativ prøve for hele lesjonen skal analyseres.
• Feil innsamling, behandling og håndtering av prøver kan føre til degradert DNA, og kan påvirke resultatenesom ble oppnådd med testen.
• En MSS-tildeling utelukker ikke tilstedeværelsen av mutasjoner som kan være til stede, men under deteksjonsgrensene for denne testen. Ytelsesegenskapene utelukker ikke falskt positive eller falskt negative resultater. Pasientens MSI-status må vurderes av en lege, sammen med andre sykdomsfaktorer, for å ta en terapeutisk beslutning.
• DNA-fragmentering/lav forekomst av amplifiserbart DNA kan gi falskt/inkonklusivt resultat.
• Forekomst av hemmere i prøven påvirker ytelsen og kan gi høyere deteksjonsgrense
• Bruk av fargede prøver kan generere ugyldige resultater.

For detaljer, se Idylla MSI Test | Biocartis

Kat.nr: A0030/6. Idylla, BioCartis.

Godkjente prøvetyper for Idylla™ NRAS/BRAF Test er FFPE-vevssnitt fra kolorektale tumorlesjoner (leverandør) Analysen er validert internt for FFPE vev med opprinnelse i malignt melanom.

Gen:

• BRAF: homo sapiens B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase NM_004333.4.
• NRAS: homo sapiens NRAS proto-oncogene, GTPase NM_002524.4.

Prosedyreprinsipp

Idylla™ NRAS-BRAF Mutation Test (CE-IVD) som utføres på Biocartis Idylla™-Systemet, er en in vitro-diagnostisk test til kvalitativ påvisning av mutasjoner i kodon 12, 13, 59, 61, 117, 146 av NRAS- onkogenet og kodon 600 av BRAF-onkogenet. Idylla™ NRAS-BRAF Mutation Test, fra prøve til resultat, starter med frigjøring av DNA fra formalinfiksert, parafininnstøpt (FFPE) humant kolorektalt kreftvev, etterfulgt av PCR-forsterkning og -påvisning i sanntid. En internkontroll tester for mengde amplifiserbar DNA i prøven. Idylla programvare tolker signalene fra PCR-reaksjonen i internkontrollen og pasientprøven.

Krav til prøver

• Minimumsmengde vev: 25 mm² (10 µm).
• Minimum tumorprosent: 10 %.

Følgende mutasjoner i NRAS og BRAF kan detekteres

Analysen kan detektere 18 mutasjoner i NRAS ekson 2, 3 og 4, samt fem mutasjoner i BRAF V600.

NRAS ekson 2:

• Kodon 12: G12D, G12C, G12S, G12A og G12V (skilles ikke mellom G12A/V).
• Kodon 13: G13D, G13R og G13V (skilles ikke mellom G13R/V).

NRAS ekson 3:

• Kodon 59: A59T.
• Kodon 61: Q61K, Q61R, Q61L og Q61H (c.183A >C og c.183A >T, skilles ikke mellom disse to).

NRAS ekson 4:

• Kodon 117: K117N (c.351G >C og c.351G >T, disse skilles ikke).
• Kodon A146: A146T og A146V, disse skilles ikke.

BRAF

• V600E/E2 og V600D, det skilles ikke mellom disse tre.
• V600K, V600R det skilles ikke mellom disse to.

Deteksjonsgrense (LOD) for de mest prevalente mutasjonene i NRAS/BRAF er ca. 5 %.

Begrensninger

• Kun for in vitro diagnostisk bruk.
• Testen skal ikke brukes til diagnostisering eller overvåkningsformål.
• Dette er en kvalitativ Test. Testen er ikke beregnet på kvantitativ måling av allelfrekvenser.
• Når det gjelder heterogenitet av prøver eller flere mutasjoner, rapporteres kun den dominante mutasjonen per gen. Heterogenitet mellom lesjoner må vurderes.
• Bruk av prøver som ikke oppfyller kriterier for mengde vev, nukleinsyrer og andel neoplastiske celler kan gi upålitelige eller ugyldige resultat eller at mutasjoner nær LOD ikke blir påvist.
• Feil innsamling eller håndtering av prøver kan føre til degradert eller deaminert DNA, og kan påvirke resultatene som ble oppnådd med testen.
• Forekomst av hemmere i prøven påvirker ytelsen og kan gi høyere deteksjonsgrense
• Bruk av fargede prøver kan generere ugyldige resultater.
• Dobbeltmutasjoner skal verifiseres med annen metode

For detaljer, se Idylla NRAS-BRAF Mutation Test | Biocartis

Kat.nr: A0171/6. Idylla, BioCartis.

Analysen er ikke validert fra leverandør. Validering er utført i eget laboratorie på FFPE tumorvev fra mamma

Prosedyreprinsipp

Idylla™ PIK3CA/AKT1F Mutation Test (RUO) er et automatisert assay som utføres på Biocartis Idylla™-Systemet. Systemet dekker hele prosessen fra prøve til resultat og inkluderer full integrert prøveopparbeidelse med påfølgende RT-PCR amplifisering og fluorescencedeteksjon av målsekvenser. En internkontroll tester for mengde amplifiserbar DNA i prøven. Idylla programvare tolker signalene fra PCR-reaksjonen i internkontrollen og pasientprøven.

Krav til prøver

• Minimumsmengde vev: 25 mm² (10 µm).
• Minimum tumorprosent: 20 %

Følgende mutasjoner i PIK3CA og AKT1 kan detekteres

Analysen kan detektere 13 mutasjoner i PIK3CA og èn i AKT1

PIK3CA

Exon 4:

• Kodon 345: N345K

Exon 7:

• Kodon 420: C420R

Exon 9:

• Kodon 542: E542K
• Kodon 545: E545A, E545G/D (skiller ikke mellom G/D), E545K
• Kodon 546: Q546E/K/R (skiller ikke mellom disse)

Exon 20:

• Kodon 1047: H1047Y, H1047R, H1047L

AKT1

Exon 2:

• Kodon 17: E17K

Begrensninger

• Testen er fra leverandør ikke IVD-godkjent. Validering er gjort i eget laboratorium.
• Kun for in vitro diagnostisk bruk.
• Testen skal ikke brukes til diagnostisering eller overvåkningsformål.
• Dette er en kvalitativ Test. Testen er ikke beregnet på kvantitativ måling av allelfrekvenser.
• Når det gjelder heterogenitet av prøver eller flere mutasjoner, rapporteres kun den dominante mutasjonen per gen. Heterogenitet mellom lesjoner må vurderes.
• Bruk av prøver som ikke oppfyller kriterier for mengde vev, nukleinsyrer og andel neoplastiske celler kan gi upålitelige eller ugyldige resultat eller at mutasjoner nær LOD ikke blir påvist.
• Feil innsamling eller håndtering av prøver kan føre til degradert eller deaminert DNA, og kan påvirke resultatene som ble oppnådd med testen.
• Forekomst av hemmere i prøven påvirker ytelsen og kan gi høyere deteksjonsgrense
• Bruk av fargede prøver kan generere ugyldige resultater.

For detaljer, se Idylla PIK3CA-AKT1 Mutation Assay | Biocartis

Analyse utføres på formalinfiksert vev

Ekstraksjon utføres på Genexus Purification System (RUO), fra Thermo Fisher

NGS (neste generasjonssekvensering) utføres på Genexus Dx Integrated Sequencer (IVD godkjent)

Prosedyreprinsipp

Det benyttes en Ion Torrent Oncomine DX Express test. Dette er en kvalitativ in vitro diagnostisk test som bruker neste generasjons sekvensering (NGS) teknologi for å detektere somatiske insersjoner, delesjoner, substitusjoner og økte kopitallsendringer i 42 gener, og fusjoner i 18 gener. Fusjonsanalyser utføres på RNA, de resterende analysene utføres på DNA.

Krav til prøver

• Minimumsmengde eluat: 10 ng
• Minimum tumorprosent: 20 % (CNV: 50 %)

Følgende gener er inkludert i genpanelet (Oncomine Dx Express kat.nr A54103):

DNA hotspots

AKT1, AKT2, AKT3, ALK, AR, ARAF, BRAF, CDK4, CHEK2, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KEAP1, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, NRAS, NTRK1, NTRK2, NTRK3, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RAF, RET, ROS1, STK11, TP53

CNV

AR, EGFR, ERBB2, ERBB3, FGFR1, FGFR2, FGFR3, KRAS, MET, PIK3CA

Fusjoner

ALK*, BRAF, ESR1, FGFR1*, FGFR2*, FGFR3*, MET, NRG1, NTRK1*, NTRK2*, NTRK3*, NUTM1, RET*, ROS1, RSPO2, RSPO3

Fusjoner merket med*: fusjons drivergener der det kan være mulighet for exon tiling imbalance

Spleisevarianter

AR, EGFR, MET

Nedre deteksjonsgrense (mutasjoner): 3,07 %- 5,57 %

Nedre deteksjonsgrense (CNV): 4,91 – 5,32 kopier

Hvis nok vevsmateriale kan KRAS screenes med Idylla KRAS mutation test kat.nr A0020 (BioCartis). Dersom påvist mutasjon, utføres ikke NGS.

Svarrapportering

Bare resultat som oppfyller følgende krav gis ut.

• Mutasjoner og kopitallsendringer: coverage > 500
• Mutasjoner: Allelfrekvens > 6
• Kopitallsendringer: kopitallratio > 6 og tumorprosent > 50 %

Usikre fusjonsfunn i ALK, ROS1, RET og MET exon 14 skipping skal bekreftes med Idylla GeneFusion panel kat.nr A0120/6 (BioCartis)

Alle funn rapporteres.

Analysering av sekvenseringsresultat er utført med Genexus Software versjon 2.0.0 og Oncomine Reporter Dx 5.5 (begge IVD).

Begrensinger

• Panelet er et målrettet panel og vil ikke detektere alle mulige varianter.
• Panelet er bare IVD godkjent for somatiske mutasjoner
• Bruk av prøver som ikke oppfyller kriterier for mengde vev, nukleinsyrer og andel neoplastiske celler kan gi upålitelige eller ugyldige resultat eller at mutasjoner nær LOD ikke blir påvist
• Forekomst av hemmere i prøven påvirker ytelsen og kan gi høyere deteksjonsgrense
• Fusjonsvarianter som bare blir detektert med ekpresjonsimbalanse (RNA exon tile fusion imbalance), bør bekreftes med annen metode.
• MET exon 14 skipping er bare validert for ikke småcellet lungekreft.
• Testen er en kvalitativ test. Den skal ikke brukes til kvantitative målinger på mutasjonsprosent.

For detaljer, se Oncomine Dx Express Test | Thermo Fisher Scientific - NO