Hemoglobinopati-utredning

Mistanke om sigdcellesykdom eller alvorlig thalassemi. Mikrocytose med eller uten anemi som ikke kan forklares av jernmangel. Utredning av bærertilstand i forbindelse med svangerskap og familieplanlegging hos pasienter fra områder med høy forekomst av hemoglobinopati. Ønske om videre utredning ved tilfeldig funn av hemoglobinopati eller mistanke om analytisk interferens ved HbA1c-analyse. Hemolyse/hemolytisk anemi (når andre, mer vanlige årsaker til hemolyse er utelukket). Polycytemi, cyanose og methemoglobinemi (sjelden).

Pasientforberedelse

• Dersom pasienten har fått blodtransfusjon de siste 3-4 månedene før prøvetakingen må dette påføres rekvisisjonen. Pasientens etnisitet, jernstatus og andre relevante opplysninger bør også påføres rekvisisjonen.
• Testing for å påvise eventuell bærertilstand (hvor pasienten ikke har symptomer eller funn) krever genetisk veiledning (Bioteknologiloven). Rekvirerende lege må sørge for at slik informasjon blir gitt der det er påkrevd.

Prøvetaking

• EDTA-blod (2 mL er ønskelig, 1 mL kan aksepteres ved vanskelig prøvetaking)
• Serum eller heparin-plasma til måling av ferritin og CRP må følge med.
• Holdbarhet ved hemoglobintyping: 7 døgn ved 2-8 °C.

HbA₂

Voksne: 2,2-3,2%

HbF

Voksne: < 1%

Kommentarer til referanseområdene

Nyfødte har svært lav HbA₂, andelen øker gradvis og når voksne verdier ved 6-12 mnd. alder.

Nyfødte har om lag 70-90 % HbF, andelen reduseres gradvis og når voksne verdier ved 6-24 mnd. alder.

Avdeling for medisinsk biokjemi, Rikshospitalet og Ullevål.

Utvidet genetisk utredning (DNA-sekvensering og kopinummeranalyse) utføres kun på Ullevål.

• Standard utredning (hemoglobintyping og α-thalassemi gentest) utføres ukentlig.
• Bestemmelse av kun hemoglobinfraksjoner ved sigdcellesykdom utføres flere ganger i uken ved Rikshospitalet.
• Ved utvidet genetisk utredning med DNA-sekvensering og kopinummeranalyse vil svartiden vanligvis være 4-8 uker.

Hemoglobinopatier er en gruppe arvelige sykdommer som skyldes defekter i syntesen av globinkjeder i hemoglobinmolekylet. Sykdomsgruppen består av thalassemier (redusert eller opphevet syntese av normale globinkjeder) og hemoglobinvarianter (syntese av globinkjeder med endret struktur). Hemoglobinopatier er sjeldne hos etnisk norske, men vanlig forekommende i tropiske og subtropiske områder som Afrika, Asia og Middelhavslandene. Den økte innvandringen til Norge fra disse områdene de siste tiårene har ført til at diagnostikk av hemoglobinopatier har blitt mer aktuelt også her i landet.

Hemoglobin består av fire globinkjeder og fire hemegrupper. Normalt hemoglobin hos voksne og barn over ett-års alder utgjøres hovedsakelig av HbA (adult hemoglobin) som består av to α-kjeder og to β-kjeder. I tillegg foreligger små mengder (2-3%) HbA₂ som består av to α-kjeder og to δ-kjeder. I fosterlivet er derimot det dominerende hemoglobinet HbF (føtalt hemoglobin) som består av to α-kjeder og to γ-kjeder. HbF utgjør omtrent 80% av barnets hemoglobin ved fødsel og erstattes gradvis av HbA i løpet av spedbarnsalderen.

Hemoglobinvarianter

Hemoglobinvarianter er forårsaket av mutasjoner som medfører endring av en eller flere aminosyrer i en av globinkjedene. De vanligste hemoglobinvariantene på verdensbasis (HbS, HbE, HbD-Punjab og HbC) skyldes aminosyreendringer i β-globinkjeden. Ved HbS (sigdcelle-hemoglobin) er den 6. aminosyren i β-globinkjeden (normalt glutaminsyre) erstattet med valin. HbS i homozygot form og HbS i kombinasjon med beta-thalassemi, HbC, HbD-Punjab, HbE samt enkelte sjeldne hemoglobinvarianter gir sigdcellesykdom av ulik alvorlighetsgrad. Sigdcelle-hemoglobinets evne til å polymerisere i deoksygenert tilstand med påfølgende formforandring av erytrocyttene er årsaken til de kliniske manifestasjonene (blant annet kronisk hemolytisk anemi, vasookklusive kriser og sekvestreringskriser) ved denne sykdommen. For øvrig finnes det mange andre rapporterte hemoglobinvarianter, både med og uten kjent klinisk betydning. Enkelte hemoglobinvarianter kan også interferere med måling av HbA1c avhengig av analysemetode.

β-thalassemi

β-globingenet (HBB) ligger på kromosom 11. Mutasjoner som fører til nedsatt (β⁺) eller opphevet (β⁰) syntese fra et av de to β-globingenene gir β-thalassemia minor med funn av mikrocytose og ofte lett anemi og/eller erytrocytose. Nedsatt eller opphevet syntese fra begge β-globingenene gir moderat (β-thalassemia intermedia) til alvorlig transfusjonskrevende thalassemi (β-thalassemia major). Barn med alvorlig β-thalassemi er friske ved fødsel og utvikler symptomer etter hvert som HbF-produksjonen avtar.

α-thalassemi

Det foreligger to α-globingener (HBA2 og HBA1) på hvert kromosom 16. Hvert individ har derfor normalt fire α-globingener. Alvorlighetsgraden ved α-thalassemi er avhengig av hvor mange av genene som er affisert. Tap av ett gen gir vanligvis lett mikrocytose, tap av to gener gir mer uttalt mikrocytose med eller uten lett anemi, tap av tre gener gir HbH-sykdom med kronisk hemolytisk anemi, og tap av alle fire genene gir Hb Barts hydrops foetalis med død intrauterint eller like etter fødsel.

Utredning

Standard utredning (utføres på alle prøver)

• Hemoglobintyping: Separerer og kvantiterer de ulike hemoglobinfraksjoner (HbA, HbA₂ og HbF samt eventuelle unormale hemoglobinfraksjoner)
• α-thalassemi gentest: Påviser syv av de vanligste delesjonene som gir α-thalassemi
• Hemoglobin, erytrocytter, MCH, ferritin og CRP, eventuelt RDW (red blood cell distribution width) og retikulocytt-hemoglobin

Utvidet utredning (utføres ved behov etter vurdering av laboratorielege)

• DNA-sekvensering av α-globingenene (HBA2 og HBA1) og β-globingenet (HBB), eventuelt δ-globingenet (HBD) og promotor av γ-globingenene (HBG2 og HBG1)
• Kopinummeranalyse av α- og β-globin genclustere

Ved hemoglobinopati-utredning utgis et tekstet svar fra laboratoriet med en samlet tolkning av funn ved hematologiske analyser, hemoglobintyping, α-thalassemi gentest og eventuelle tilleggsanalyser.

Hemoglobintyping

HbA₂

HbA₂ > 4% kombinert med en normal, dominerende HbA og typiske hematologiske funn (mikrocytose, ofte erytrocytose og/eller lett anemi) gir diagnosen beta-thalassemia minor. HbA₂-verdier mellom ca. 3,5% og 4,0% regnes som et gråsone-område hvor utvidet genetisk utredning kan være nødvendig for å avklare diagnosen. Også HbA₂-verdier fra 3,3% - 3,5% kan i sjeldne tilfeller ses ved lette β-thalassemi-mutasjoner. Dersom δ-globingenet er affisert i tillegg til β-globingenet vil ikke HbA₂ være økt. Hos barn under 1 år kan ikke diagnosen β-thalassemia minor utelukkes basert på HbA₂-verdien, da denne øker i første leveår. Analysen må eventuelt gjentas etter ett-års alder ved fortsatt mistanke om lett β-thalassemi. Ved mistanke om mer alvorlige former for β-thalassemi blir diagnosen verifisert med genetiske undersøkelser. Lett redusert HbA₂-verdi kan ses ved α-thalassemi og jernmangel.

HbF

Forhøyet HbF hos voksne og barn over ett-års alder kan ses ved β-thalassemi, sigdcellesykdom, homozygot HbE, sammensatt HbE/β-thalassemi, δβ-thalassemi og hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH). Økt HbF kan også ses ved maligne sykdommer i benmargen, aplastisk anemi, Fanconi anemi, erytropoietisk stress, behandling med enkelte cytotoksiske medikamenter (f.eks. hydroksyurea) eller graviditet. Ved graviditet vil HbF-nivået normalt ikke overstige 5%.

Hemoglobinvarianter

Hemoglobinvarianter påvises ved hemoglobintyping og/eller DNA-sekvensering. Laboratoriet gir informasjon om variantens kliniske betydning i svaret.

α-thalassemi gentest

α-thalassemi gentest påviser syv ulike delesjoner som gir α-thalassemi. α⁰-delesjoner gir tap av begge α-globingenene (HBA2 og HBA1) på affisert kromosom og kan forklare en moderat til uttalt mikrocytose, erytrocytose og/eller lett anemi. α⁺-delesjoner gir tap av kun ett α-globingen på affisert kromosom og kan forklare en lett mikrocytose, erytrocytose og eventuelt en svært lett anemi. Normal hematologi utelukker ikke at det kan foreligge en lett α-thalassemi.

De ulike delesjonene testen kan påvise

α⁰-delesjoner:

• --^SEA
• --^FIL
• --^MED
• --^THAI
• -(α)^20.5

α⁺-delesjoner:

• - α^3.7
• - α^4.2

α-thalassemi gentest påviser om lag 90% av alle α-thalassemier. Andre α-thalassemier (punktmutasjoner og sjeldne delesjoner) påvises ved DNA-sekvensering og kopinummeranalyse.

Arv

Hemoglobinopatier er arvelige. Tabellene nedenfor gir en veiledende oversikt over hvilke tilstander barnet har risiko for arve ved ulike kombinasjoner av hemoglobinopati hos foreldrene. Kun de vanligste hemoglobiopatiene er oppgitt i tabellene. Andre sjeldne former for hemoglobinopati kan også være forbundet med risiko for å arve alvorlig sykdom.

β-globingenet

α-globingenene:

Hemoglobintyping utføres ved HPLC (high performance liquid chromatography) og kapillærelektroforese.

Alfa-thalassemi gentest utføres ved konvensjonell PCR⁷.

DNA-sekvensering utføres ved Sangersekvensering. Sekvenseringen av HBA1, HBA2, HBB og HBD dekker promotorområdet, exon, intron (IVS) og 3'UTR. For HBB og HBD er det et mindre område i IVS2 som ikke dekkes.

Referansesekvenser:

• HBA1 : NM_000558.4
• HBA2 : NM_000517.4
• HBB : NM_000518.4
• HBD : NM_000519.3

Kopinummeranalyse utføres ved kvantitativ sanntids-PCR. Kopinummeranalyse av alfa-globin genclusteret utføres rutinemessig med assay som dekker HBA1 og HBA2 samt regulatorisk område for disse (HS-40). Kopinummeranalyse av beta-globin genclusteret utføres rutinemessig med assay som dekker HBB og HBD og suppleres med assay for HBG1, HBG2 og HBE1 ved behov.