Analyseprinsipp

Et immunoassay er en biokjemisk test som brukes til å måle konsentrasjonen av en analytt basert på binding mellom analytten (antigenet) og ett eller flere spesifikke antistoffer. Metoden er avhengig av interaksjon mellom et antistoffs bindingssete (paratop) og epitopet (immunogent sete) på antigenet. Analyser basert på immunoassay-prinsippet kan deles inn i to hovedgrupper: Kompetitive assays (reagens underskuddsassays) og non-kompetitive assays (reagens overskuddsassays).

Kompetitive assays

De kompetitive assays benytter seg av at reaksjonen mellom antigenet (analytten) som skal kvantiteres, og det spesifikke antistoffet er reversibel. Metoden består i at en blanding bestående av en konstant mengde merket antigen og antistoff inkuberes, det siste i underskudd, og en variabel mengde umerket antigen til stede i standarder eller ukjent prøve. Under inkuberingen vil det da oppstå en konkurranse mellom merket og umerket antigen om det begrensede antall antistoff-bindingsseter. Bindingen av merket antigen til antistoff vil følgelig være omvendt proporsjonal med mengden umerket antigen til stede.

Etter endt inkubering er det nødvendig å skille bundet og ubundet merket antigen for at det såkalte responssignalet skal kunne måles. På grunnlag av det målte responssignalet (fritt eller bundet merket antigen) i de respektive standarder konstrueres en standardkurve, og på grunnlag av det målte responssignalet i de ukjente prøver, kan mengde antigen (analytt) beregnes.

I prinsippet anvendes to forskjellige separasjonsprosedyrer. Den ene baserer seg på isolasjon av fritt merket antigen, mens den andre baserer seg på isolasjon av merket antigen-antistoff-kompleks. Av de to metodene er den siste mer robust enn den første. Årsaken til dette er at når fritt antigen isoleres (adsorberes), vil det dannede antigen-antistoff-kompleks begynne å dissosiere. Dersom separasjonstiden ikke er like lang for alle prøver, vil graden av dissosiasjon være forskjellig, særlig dersom dissosiasjonshastigheten er høy. De fleste moderne kompetitive immunoassays baserer seg derfor på isolasjon av merket antigen-antistoffkompleks, enten ved at primær-antistoff eller et sekundær-antistoff er bundet til en fast fase (for eksempel en brønn i en mikrotiterplate).

I og med at det benyttes kun en epitop på analytten og et antistoff, kan kompetitive immunoassays benyttes til bestemmelse av både små (eks. tyroksin) og store (eks. proteinhormoner) analytter.

Non-kompetitive assays

Non-kompetitive immunoassays baserer seg på at det benyttes to forskjellige antistoffer rettet mot to forskjellige epitoper på det antigenet (analytten) som skal kvantiteres. Det ene antistoffet er som regel immobilisert (bundet til en fast fase), mens det andre er bærer av et eller annet egnet merkestoff, og fungerer derved som merket reagens. De to anvendte antistoffene benyttes i overskudd, slik at all tilgjengelig analytt i prøven bindes til det immobiliserte antistoffet under inkubering. Det merkede antistoffet vil også bindes til de samme analyttmolekyler, og mengden bundet merket antistoff vil derfor direkte gjenspeile mengden analytt til stede.

På samme måte som ved de kompetitive assays, er det nødvendig å skille bundet og ubundet merket antistoff etter endt inkubering for at responssignalet skal kunne måles. Som nevnt vil de non-kompetitive assays nesten alltid operere med det ene antistoffet koblet til en fast fase, og kalles derfor ofte for to-sidige immunometriske "sandwich" assays.

I og med at det benyttes to eptioper på analytten og to antistoffer, kan denne type immunoassay bare benyttes til bestemmelse av anlytter som er store nok til å inneholde to uavhengige epitoper.

Homogene immunassays

Kravet om stadig hurtigere analysesvar, sammen med behovet for forenklede analyser, har ført til en økende etterspørsel etter metoder der man ikke behøver å skille fritt og bundet merket reagens for måling av responssignalet (homogene assays). Metoden er basert på at merkestoffets egenskaper er forskjellige i fri og bunden form.

Merkestoffer

De non-kompetitive metoder er langt mere sensitive og spesifikke enn de tidligere kompetitive assays. Dette skyldes i vesentlig grad anvendelsen av monoklonale antistoffer og innføringen av nye typer merkestoffer med langt høyere spesifikk aktivitet enn det man kunne oppnå ved merking med radioaktivitet.

I de første kompetitive assays ble det utelukkende benyttet radioaktivitet som merkestoff. Etter hvert ble det også introdusert andre merkestoffer som f.eks. merking med enzym eller fluorescerende prober. Kravet om mer og mer sensitive immunometriske metoder, behovet for en økende grad av rasjonalisering, kravet om økt holdbarhet av merket reagens og strengere rutiner i forbindelse med kast og arbeid med radioaktive stoffer har ført til en stadig søken etter nye merkestoffer og innføring av såkalte "black box" instrumenter. Merkestoffer som luminol og akridin-estere (kjemiluminiscens) og lantanid-chelater (time-resolved fluorescense) har på grunn av dette sett dagens lys.

Beregning av resultater

For å kvantifisere mengden analytt i en prøve sammenligner man responssignalet fra prøven med responsignal fra standarder med kjent mengde antigen. Dette gjøres ved at responssignalet i standardene brukes til å konstruere en standardkurve som man bruker til å bestemme konsentrasjonen av anlytt i en prøve.

I dag anvendes en rekke forskjellige merkede reagenser med responssignaler basert på vesentlig forskjellige prinsipper, og bruk av spesielle instrumenter til endepunktsmåling er i stadig større grad nødvendig. Uansett type analyseinstrument er utstyret tilkoplet en datamaskin som kan konstruere en standardkurve, beregne resultater, overføre svar til laboratoriedatasystemet og produsere relevante kvalitetskontrolldata. Til konstruksjon av standardkurven brukes det følgende tre metoder i forbindelse med denne funksjonen:

• Dataprogram som baserer seg på den teoretiske modellikning som gjelder for reaksjon mellom antigen og antistoff.

• Dataprogram som baserer seg på en matematisk empirisk kurvetilpasning.

• Program som baserer seg på forskjellige interpolasjonsteknikker.

Feilkilder

Som nevnt innledningsvis baserer et immunoassay seg på binding mellom et antigen (standard eller analytt) og ett eller flere mer eller mindre spesifikke antistoffer. Alle substanser som kan påvirke binding mellom analytt og antistoff, vil kunne gi opphav til feilaktige resultater. Det er derfor vanlig med mye større usikkerhet i immunoassays enn i vanlige klinisk-kjemiske analyser hvor en egenskap av analytten bestemmes direkte.

Under er det listet opp en del faktorer som kan føre til uriktige analysesvar ved benyttelse av analyser basert på immunoassay-prinsippet.

• Uspesifikt antistoff (gir opphav til kryss-reaksjon)

• Spesifikt monoklonalt antistoff (kan overse isoformer)

• Ufullstendig separasjon av bundet og ubundet antigen

• Binding av merkelapp til annet enn spesifikt antistoff (uspesifikk binding, NSB (non-specific binding))

• Substanser som kan påvirke responssignalet

• Forskjellig matrix i standardprøver og pasientprøver

• Interferens i form av heterofile antistoffer eller revmatoid faktor i prøven

Dersom Hormonlaboratoriet mistenker interferens i et analysesvar vil analysen utføres med en alternativ metode, dersom dette er tilgjengelig.

Analyseprinsipp

Kromatografi er en separasjonsmetode basert på to ikke blandbare faser. Den ene fasen er mobil (mobilfasen) og den andre stasjonær (stasjonærfasen). En prøve blir injisert i den mobile fasen og transportert gjennom en kolonne langs den stasjonære fasen. De ulike stoffer fordeler seg mellom eller vekselvirker med de to fasene i forskjellig grad og separeres dermed. Vanlige kromatografimetoder er:

Væskekromatografi (Liquid Chromatography, LC), der den mobile fasen er en væske og den stasjonære fasen er et fast stoff.

Gasskromatografi (GC), der den mobile fasen er et gass og den stasjonære fasen er en væske.

Ved Hormonlaboratoriet brukes LC som kromatografisk metode.

Separasjonsprinsippet som er brukt er omvendt-fase kromatografi, der den mobile fasen er polar, en vandig væske (vandig buffer, MeOH, acetonitril) og den stasjonære fasen er hydrofob (C18, PFP). Separasjonen er basert på interaksjoner mellom analytt og stasjonærfase, og de viktigste interaksjonene er van der Waal krefter (svake hydrofobe krefter) som øker med størrelsen av analytten.

I omvendt-fase kromatografi har polare stoffer (stoffer med mange –OH, –NH3, =O grupper) minst retensjon, mens hydrofobe stoffer (stoffer med mange –CH– grupper) har høyest retensjon.

LC instrumentene deles inn i HPLC (High Performance LC) og UHPLC (Ultra High Performance LC). Forskjellen er partikkelstørrelsen brukt i separasjonskolonnen. Typisk partikkelstørrelse i HPLC er 3,5-10μm, mens den er < 2μm i UHPLC. Mindre partikler i kolonnen betyr høyere mottrykk, og et UHPLC system må derfor tåle trykk på opp til 1200 bar. Fordelen med UHPLC er raskere separasjon (< 5 min på UHPLC vs. > 10-15 min på HPLC) og smalere topper, noe som fører til at det kan separeres flere analytter per tidsenhet.

Deteksjon

For å få et kromatogram (konsentrasjonsprofil mot tiden) må en detektor inngå i instrumenteringen. Den skal gi et elektrisk signal når de forskjellige stoffer eluerer fra kolonnen.

Følgende detektorer brukes ved Hormonlaboratoriet:

• Elektrokjemisk detektor som detekterer komponenter som kan oksyderes eller reduseres.
• MS (Massespektrometri) som baserer seg på ionisering av analytten etterfulgt av separasjon av ionene i gassfase basert på masse-ladningsforhold (m/z).
• UV (Ultra Violett absorpsjonsdetektor) som detekterer komponenter som absorberer UV-lys.

Massespektrometri

For å kunne bruke MS, må analytten(e) ioniseres. De vanligste ioniseringsteknikkene for små eller mellomstore molekyler er:

• Elektrospray ionisering (ESI)
• Atmosfærisk trykk kjemisk ionisering (APCI)
• Atmosfærisk trykk foto ionisering (APPI)

Alle ioniseringsteknikkene lager først og fremst intakte molekylioner. Videre fragmentering skjer i masseanalysatoren. ESI er den mest brukte ioniseringsteknikken og denne brukes også ved Hormonlaboratoriet. Eluenten fra LC systemet introduseres gjennom et kapillær i ionekilden, og et spray lages ved hjelp av nitrogengass og varme samtidig som det settes på en spenning. Ideelt skal analytten være ladet i mobilfasen, ellers skjer ladningsoverføring samtidig med dråpedannelsen i sprayen.

Separasjon av ionene skjer i masseanalysatoren, og her finnes det også flere typer å velge mellom:

• Kvadrupol (Q) eller trippel kvadrupol (QQQ), som er egnet for små molekyler og analser der analytten er kjent (targeted analysis). På grunn av høy sensitivitet og spesifisitet er QQQ ofte brukt i rutineanalyser.
• Time-of-flight (TOF), som er egnet til proteiner (på grunn av bedre masse oppløsning).
• Orbitrap (OT) som er egnet til proteomikk/metabolomikk og har en bedre masse oppløsning og mulighet for å utføre MS/MS.

Ved Hormonlaboratoriet brukes QQQ masseanalysatorer.

Feilkilder

Med kromatografiske metoder måles konsentrasjonen av analytten direkte. Feilkilder innebærer:

• manglende separasjon av interferenser
• tap av analytt under prøveopparbeidelse (dårlig utbytte)

Før Hormonlaboratoriet tar i bruk en ny analysemetode blir en metodevalidering utført. Metodevalidering av immunologiske og kromatografiske metoder er beskrevet i en egen prosedyre.

Det bør det i størst mulig grad etableres referansegrenser for følgende grupper: Friske ikke hospitaliserte, syke, barn, voksne, eldre, menn og kvinner. Ved Hormonlaboratoriet blir følgende materialer brukt for å etablere grensene:

• Serum fra friske blodgivere, menn og kvinner

• Serum fra frivillige studenter/ansatte

• Serum fra hospitaliserte pasienter som lider av sykdommen

• Serum fra friske personer som er med i andre kliniske studier

Det benyttes også referansegrenser som er bestemt av leverandøren av metoden eller fra publisert materiale. I slike tilfeller bekreftes referansegrensene med minst 20 prøver fra en av gruppene som nevnt ovenfor.

For å sikre høy kvalitet på de daglige rutineanalyser er det nødvendig å ha implementert et kvalitetssikringsprogram (QA). Et av elementene i kvalitetssikring er analyse av interne kvalitetskontroller. Kontroller på minst to konsentrasjonsnivåer analyseres.

Internkontrollene analyseres i hver serie, og konsentrasjonene føres på et eget kontrollark (Shewart plot). Analyse av internkontroller gjør det mulig kontinuerlig å følge metodenes reproduserbarhet.

Alle laboratoriets akkrediterte metoder er med i et eksternt kvaltetssikringsprogram (EQAS), en ringtest med andre laboratorier eller det inngår produsent-uavhengige kontroller. I EQAS program får laboratoriet tilsendt ukjente prøver som analyseres som en rutineprøve. Svaret sendes til EQAS leverandøren som sender ut rapporter som viser hvordan laboratoriets prøvesvar samsvarer med de andre deltagende laboratoriene.