Mikrobiologiske analysemetoder

Ved mikrobiologisk laboratoriediagnostikk benyttes en rekke ulike analysemetoder. Hvilken metode som er best egnet avhenger blant annet av hvilket agens som skal påvises og hvor i sykdomsforløpet pasienten befinner seg. Basal kunnskap om de forskjellige metodene er en viktig forutsetning for presis og pålitelig diagnostikk.

 

Det gis her en kortfattet, generell beskrivelse av analysemetodene som benyttes ved Mikrobiologisk avdeling. For spesielt interesserte anbefales lærebøker i medisinsk mikrobiologi (se referanselisten).

Hovedkategorier

Undersøkelsene som utføres ved vårt laboratorium kan inndeles i to hovedkategorier:

• Agensrettede undersøkelser, som omfatter etiologisk diagnostikk og vurdering av immunstatus ved infeksjonssykdommer, med direkte eller indirekte metoder.
• Diagnostikk ved immunologiske og revmatologiske sykdommer, med påvisning av autoantistoffer (som ikke er rettet mot mikrober, men mot kroppens egne celler eller strukturer) eller bestemmelse av vevstype. Dette er ikke mikrobiologisk diagnostikk og omtales derfor ikke nærmere.

 

Figuren nedenfor viser hvilke analysemetoder som benyttes ved agensrettede undersøkelser ved vårt laboratorium og hva som påvises med de ulike metodene.

 

Direkte og indirekte metoder

Agensrettede undersøkelser kan utføres med direkte eller indirekte metoder.

Direkte analysemetoder innebærer påvisning av selve det infeksiøse agens, eller komponenter fra dette. Som direkte metoder regnes følgende:

• Påvisning av selve mikroben ved hjelp av dyrkning og/eller mikroskopi.
• Påvisning av antigener eller toksiner fra mikroben med tester for antigenpåvisning eller toksinpåvisning.
• Påvisning av mikrobens RNA eller DNA ved hjelp av molekylærbiologiske metoder for nukleinsyrepåvisning.

 

Ved bruk av indirekte metoder påvises kroppens immunsvar mot det infeksiøse agens. Ved vårt laboratorium innebærer dette påvisning av antistoffer av klasse IgG og/eller IgM. Serologi eller infeksjonsimmunologi brukes ofte som felles betegnelser for disse undersøkelsene.

Andre indirekte metoder er basert på påvisning av interferoner. Prøver til interferonbasert analyse (TB-IGRA) gjøres ved utredning av latent tuberkulose.

 

Generelle og spesifikke metoder

Mikrobiologiske analysemetoder kan også deles inn i generelle og spesifikke metoder. Med spesifikke metoder kan man ved den enkelte analyse kun påvise én spesifikk mikrobe. Eksempler er antigen-, nukleinsyre- og antistoffpåvisning. Med slike analyser undersøkes prøven med tanke på én spesifikk mikrobe, og resultatet blir påvist eller ikke påvist (evt. inkonklusivt/usikkert).

 

Ved bruk av generelle metoder gir derimot én og samme undersøkelse mulighet for å påvise alle mikrober som metoden er egnet for. Dyrkning og mikroskopi er eksempler på generelle metoder, og ved slike undersøkelser vil resultatet ofte kunne være at flere mikrober er påvist. Med selektive medier og spesielle fargeteknikker kan imidlertid også disse metodene gjøres spesifikke i varierende grad.

 

For optimalt utbytte ved mikrobiologisk diagnostikk er det viktig at det letes etter rett agens med rett metode i rett prøvemateriale på rett tidspunkt i sykdomsforløpet. Før prøvetakingen kan det derfor være nyttig å tenke igjennom følgende spørsmål:

• Hvilke(n) mikrobe(r) skal det letes etter?
• Hvilke(n) analysemetode(r) kan brukes til å påvise denne/disse?
• Hvilken analysemetode er best egnet på det aktuelle tidspunktet i sykdomsforløpet?
• Hvilke typer prøvemateriale er egnet for den aktuelle undersøkelsesmetoden?

 

Dyrkning

Ved dyrkning påvises hele, levende mikrober, og metoden er velegnet for påvisning av bakterier og sopp som lar seg dyrke på vanlige medier. Bakterier som er svekket eller døde som følge av antibiotikabehandling kan være vanskelig eller umulig å påvise med dyrkning. Supplerende undersøkelse med mikroskopi og/eller nukleinsyrepåvisning kan da være til hjelp. Virusdyrkning og dyrkning av parasitter utføres ikke ved vårt laboratorium.

 

Mange forskjellige prøvematerialer kan benyttes til dyrkning, avhengig av klinisk problemstilling. Vanlige materialer er urin, puss og sårsekret, sekret fra luftveier og genitalia, samt blodkultur og spinalvæske. Ved rekvirering av generell bakteriologisk undersøkelse vil laboratoriet undersøke prøvematerialet for alle relevante bakterier. Ved rekvirering av spesifikke dyrkningsanalyser (f.eks. MRSA, gonokokker og gruppe B-streptokokker) vil prøven kun bli undersøkt med henblikk på aktuell mikrobe.

 

Prøvene sås ut på faste og/eller flytende medier og inkuberes deretter i 1-5 dager (unntaksvis lengre) ved en temperatur og CO2-konsentrasjon tilpasset den mikroben man ønsker å påvise. For påvisning av kravfulle mikrober er valg av medium, inkuberingstid og temperatur/atmosfære avgjørende for resultatet. Gode kliniske opplysninger hjelper laboratoriet til å analysere prøven på best egnet måte og er derfor en forutsetning for god kvalitet på undersøkelsen.

 

Ved vekst av bakterier som vurderes som patogene eller mulig patogene, utføres vanligvis resistensbestemmelse mot aktuelle antibiotika. Dyrkning er (med enkelte unntak) den eneste metoden som gir mulighet for resistensbestemmelse av bakterier.

 

Mikroskopi

Prøvematerialet prepareres og farges og studeres i mikroskopet. Ved mikroskopi påvises vanligvis hele mikroben. Undersøkelsen kan oftest ikke skille mellom døde og levende organismer. Mikroskopi er i prinsippet en generell undersøkelse, men kan ved hjelp av ulike fargeteknikker gjøres spesifikk.

 

Mikroskopi utføres ofte som supplement til dyrkning av bakterier og sopp. I tillegg gjøres mikroskopi av feces, eller annet egnet materiale, ved mistanke om infeksjon med innvollsorm og ikter. Ved mistanke om bestemte parasitter bør dette opplyses på rekvisisjonen, slik at spesifikk undersøkelse kan utføres fra rett transportmedium.

 

Antigenpåvisning

Antigener er mikrobestrukturer, mikrobeprodukter eller områder på mikrobens overflate som kroppens immunforsvar kan danne antistoffer mot. Antigentester er basert på spesifikk antistoff-antigenbinding. Testene kan benyttes på materialer hvor mikroben eller nedbrytningsprodukter fra mikroben kan finnes.

Laboratoriet har antigentester for påvisning av visse typer bakterier, f.eks. urinantigentester ved mistanke om Legionella pneumophilia eller Streptococcus pneumoniae. Antigentester inngår også i serologisk påvisning av Hepatitt B virus og HIV.

 

Toksinpåvisning

Toksiner er mikrobeprodukter med toksisk effekt og kan påvises ved hjelp av metoder som benytter spesifikke antistoffer mot toksinet, tilsvarende som ved antigentester. Den eneste analysen ved vårt laboratorium som er basert på toksinpåvisning er Clostridioides difficile. Positivt resultat kan bestå i lang tid etter at infeksjonen er overvunnet.

 

Nukleinsyrepåvisning

Nukleinsyrer er en fellesbetegnelse for arvestoff (RNA eller DNA). Nukleinsyrepåvisning utføres med molekylærbiologiske metoder, som PCR (Polymerase Chain Reaction) eller TMA (Transcript Mediated Amplification). Vi benytter både kommersielle og egenproduserte analyser for nukleinsyrepåvisning. De fleste analysene har høy sensitivitet og spesifisitet og har de senere år i stor grad tatt over for analyser basert på andre metoder, spesielt antigen- og antistoffpåvisning.

 

Nukleinsyrepåvisning er velegnet til virusdiagnostikk, blant annet ved luftveisinfeksjoner, gastroenteritt, encefalitt og som supplerende undersøkelse når det er påvist antistoffer mot Hepatitt C virus.

Nukleinsyrepåvisning brukes også for påvisning av bakterier som ikke kan dyrkes på vanlige medier, f.eks. Chlamydia trachomatis, atypiske bakterier (Mycoplasma pneumoniae/Chlamydia pneumoniae) og til påvisning og/eller konfirmering av bestemte underkategorier av bakterier som MRSA og EHEC/EIEC. I fecesdiagnostikken brukes PCR som undersøkelse for de vanlige tarmpatogener, og positivt resultat suppleres med dyrkning der det er aktuelt.

 

Nukleinsyrepåvisning kan utføres i de fleste prøvematerialer. Valg av materiale avhenger av klinisk problemstilling og hvor man kan forvente å finne den aktuelle mikroben. Positivt resultat betyr at mikrobens nukleinsyre er til stede i prøvematerialet, men skiller ikke mellom levende og døde mikrober. Analysen kan derfor i noen tilfeller være positiv i flere uker etter at infeksjonen er sanert, f.eks. ved genital klamydiainfeksjon.

 

Serologi/infeksjonsimmunologi

Med serologi og infeksjonsimmunologi menes hovedsakelig antistoffpåvisning i serum (evt. plasma), men begrepene omfatter hos oss også antigenpåvisning (Hepatitt B virus og HIV). I noen tilfeller utføres antistoffpåvisning i andre prøvematerialer, eksempelvis antistoffer mot Borrelia burgdorferi i spinalvæske.

Antistoffer er synonymt med immunglobuliner (Ig) og disse inndeles i klasser. Ved serologisk infeksjonsdiagnostikk hos oss påvises spesifikke antistoffer av klasse IgG og/eller IgM rettet mot bakterie- eller virusantigener.

 

Antistoffresponsen ved ulike infeksjoner er svært forskjellig med hensyn til når antistoffer av forskjellige klasser dannes, og hvor lenge antistoffene persisterer etter gjennomgått infeksjon:

IgM dannes i akuttfasen av sykdom (og enkelte ganger etter vaksine) og forsvinner vanligvis etter noen uker eller måneder, men kan dannes på ny ved reaktivering av visse typer virus innen herpesvirusgruppen.

IgG dannes oftest senere enn IgM, og kan bestå i lang tid, noen ganger livet ut, som tegn på gjennomgått infeksjon og i noen tilfeller immunitet. IgG kan også påvises etter vaksine. Opplysninger om vaksinering er derfor viktig, spesielt ved rekvirering av analyser mht. Hepatitt A virus, Hepatitt B virus og TBE-virus.

 

Kunnskap om antistoffrespons ved ulike infeksjoner og kliniske opplysninger fra rekvisisjonen danner grunnlaget for tolkningen av eventuelle funn av antistoffer i serumprøve. Spesielt er opplysninger om tidspunktet for symptomdebut helt nødvendig for at laboratoriet skal kunne foreta en god vurdering av prøveresultatet. Er prøven tatt før antistoffdannelse kan forventes, vil resultatet nødvendigvis bli negativt, selv om pasienten skulle være infisert med den aktuelle mikroben.

 

Serologiske analyser skiller ikke mellom antistoffer pasienten har produsert selv, og antistoffer som er tilført gjennom behandling med intravenøst immunglobulin (IVIG). IVIG-preparater inneholder antistoffer mot en lang rekke vanlig forekommende agens. Dersom det tas serologiske prøver av pasienter som har mottatt IVIG, er det viktig at dette opplyses om på rekvisisjonen for at tolkningen av resultatene skal bli riktig.